Dieses lichtinduzierte Dielektrophorese-Protokoll (LiDEP) bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Charakterisierung humaner mesenchymaler Stammzellen. Diese Methode kann helfen, Antworten auf die Heterogenität von Stammzellproben zu geben. Der Vorteil von LiDEP ist die Möglichkeit, als Reaktion auf die Heterogenität der Stammzellen in Echtzeit Änderungen an der virtuellen Elektrodenkonfiguration vorzunehmen, was mit herkömmlichen DEP-Methoden nicht möglich ist.
Ein neuer Benutzer dieser Technik könnte Schwierigkeiten haben, das Projektorlicht so weit auf das mikrofluidische Gerät zu kondensieren, dass die virtuelle Elektrode hergestellt wird. Wir empfehlen, das Setup neu zu konfigurieren, bis es funktioniert. Zuri Rashad, ein Doktorand aus meinem Labor, wird bei der Demonstration des Verfahrens helfen.
Um den Mikrokanal vorzubereiten, stanzen Sie Löcher mit einem Durchmesser von vier Millimetern auf ein doppelseitiges Klebeband, etwa fünf bis sechs Millimeter vom Rand des kürzeren Maßes entfernt und zentriert zwischen den längeren Seiten des Bandes. Schneiden Sie mit einem Skalpell zwei gerade Linien im Abstand von drei Millimetern über die Löcher und stellen Sie sicher, dass die Schutzfolien auf beiden Seiten des Klebebandes während des gesamten Mikrokanalschneidens angebracht sind. Markieren Sie die gesamte Stelle mit einem abwaschbaren Marker und stellen Sie sicher, dass die gebohrten Löcher mit den Löchern übereinstimmen, die in das doppelseitige Klebeband gestanzt wurden.
Diese beiden Löcher werden als Einlass- und Auslasslöcher des mikrofluidischen Geräts verwendet. Bohren Sie zwei Löcher mit einem Durchmesser von drei Millimetern in den oberen ITO-Objektträger. Legen Sie als Nächstes die lange Kante des Klebebandes auf die Oberseite des gebohrten ITO-beschichteten Glases und richten Sie sie an der langen Kante des Glases aus.
Entfernen Sie eine Seite der Schutzfolie auf dem doppelseitigen Klebeband. Richten Sie die Löcher des Klebebandes im oberen ITO-Objektträger aus und drücken Sie sie vorsichtig zusammen, um Lufteinschlüsse zu entfernen, insbesondere in der Nähe des Mikrokanals. Entfernen Sie die andere Schutzfolie vom doppelseitigen Klebeband.
Drücken Sie auf das mit Molybdän und amorphem Silizium beschichtete ITO-Glasobjektträger, wobei die Kante des photoleitenden Objektträgers gegenüber der zwei Millimeter großen Abstandsseite mit der Kante des doppelseitigen Klebebandes zur Mitte des oberen ITO-Glasobjektträgers hin ausgerichtet ist. Auf diese Weise entsteht ein Kater zwischen dem ITO und dem fotoleitfähigen ITO-Objektträger. Drücken Sie auf eine ebene Fläche, um eine gute Haftung zu gewährleisten, und schneiden Sie das überschüssige Klebeband an den Seiten ab.
Um den Funktionsgenerator anzuschließen, bringen Sie Kupferband an den Rändern der ITO-Glasschicht und der photoleitfähigen, beschichteten ITO-Glasschicht an. Wickeln Sie das Klebeband an der Seite des ITO oder des photoleitenden Materials vom Rand des doppelseitigen Klebebandes bis etwa drei Zentimeter auf die unbeschichtete Seite des Glassubstrats. Um eine erfolgreiche Herstellung des Geräts sicherzustellen, verwenden Sie einen Höhenmesser, um den Widerstandswert zwischen den beschichteten Objektträgern beider Glassubstrate und dem Kupferband, das am Glas befestigt war, zu testen.
Geben Sie 25 Milliliter Reinstwasser in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 4,25 Gramm Saccharose und 0,15 Gramm Glukose. Gut mischen, bis sich die Hälfte der Saccharose und der Glukose aufgelöst hat, und mit Reinstwasser bis zur 50-Milliliter-Marke auffüllen. Mischen Sie dann diesen DEP-Puffer kräftig, bis er sich vollständig aufgelöst hat.
Geben Sie 20 Milliliter der vorbereiteten Saccharose-Glukose-Lösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 0,1 Gramm Rinderserumalbumin, BSA, in die Tube. Wirbeln Sie gut, bis sich das gesamte BSA aufgelöst hat, um eine Endkonzentration von 0,5 % BSA im DEP-Puffer zu erhalten.
Geben Sie HEK293 ein mal 10 zu den sechs humanen mesenchymalen Stammzellen oder HMSCs oder der menschlichen embryonalen Niere, suspendiert in einem Milliliter Wachstumsmedium in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die HEK293-Zellen bei 201 G für fünf Minuten und die HMSCs bei 290 G für 10 Minuten. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt.
01 Und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in einem Milliliter DEP-Pufferlösung mit 0,5 % BSA. Wiederholen Sie die Zentrifugation noch zwei weitere Male und resuspendieren Sie die Zellen im DEP-Puffer mit 0,5 % BSA. Bereiten Sie die Elemente des Versuchsaufbaus vor, wie z. B. einen Laptop, einen Projektor, eine Objektivlinse, ein digitales Mikroskop und einen Funktionsgenerator zur Quantifizierung der zellulären Reaktionen auf LiDEP.
Positionieren Sie das 10-fach-Objektiv, den LiDEP-Chip und die Halterung oben auf dem Projektorobjektiv. Verwenden Sie den Laptop, um Lichtprojektionen wie Stern, Diamant, drei Linien und Oval zu entwerfen, und schließen Sie den Laptop an den Projektor an. Verbinden Sie den LiDEP-Chip mit dem Funktionsgenerator, um das elektrische Wechselfeld anzulegen.
Um die Zellen zu beobachten, die der LiDEP-Kraft ausgesetzt sind, verwenden Sie ein digitales Mikroskop für die bildgebende NVIDIA-Aufzeichnung. Spülen Sie nach Abschluss des Setups den Mikrokanal mit 70 % Ethanol und spülen Sie dann 0,5 % BSA-Lösung, um das Ethanol in den vorherigen Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie die Spülung dreimal, um sicherzustellen, dass sie vollständig abgewaschen werden, da zuvor dem DEP-Feld ausgesetzte Zellen anders reagieren als frische Zellen und die Datenerfassung stören können.
Entfernen Sie die 0,5%ige BSA-Lösung mit einer Pipette. Stellen Sie anschließend den Funktionsgenerator auf die gewünschte Spannung und Frequenz ein. Geben Sie vorsichtig 70 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension mit einer kleineren Pipettenspitze in den Mikrokanal des Geräts und kippen Sie sie leicht in das Loch in Richtung des Mikrokanals, um ein Verschütten aufgrund der Dünnheit des Mikrokanals zu vermeiden.
Wischen Sie die Zugangslösung mit Einweg-Papiertüchern ab und entsorgen Sie sie im Abfall für biologisch gefährliche Abfälle. Projizieren Sie dann die gewünschten virtuellen Kreise, Diamanten, Sterne oder parallelen Linien auf den LiDEP-Chip. Stellen Sie in der Digitalmikroskop-Software die Videolänge auf drei Minuten ein.
Stellen Sie einen Lab-Timer auf zwei Minuten und 30 Sekunden ein. Sobald die Zellen im Mikrokanal des LiDEP-Chips stationär sind, drücken Sie in der digitalen Mikroskopsoftware auf Start, um den Videoaufzeichnungsprozess zu starten. Drücken Sie nach 10 Sekunden die Ein-Taste des Kanalausgangs des Funktionsgenerators, um das elektrische Wechselfeld anzulegen, und drücken Sie Start für den Timer.
Überwachen Sie das DEP-Verhalten der Zelle durch das digitale Mikroskop und verhindern Sie Verwacklungen oder Bewegungen im Aufbau. Sobald der Timer abgelaufen ist, drücken Sie die Ein-Taste des Kanalausgangs des Funktionsgenerators, wodurch der Kanalausgang ausgeschaltet wird und das elektrische Wechselfeld nicht mehr durch die Elektroden zugeführt wird. Stoppen Sie die Videoaufzeichnung nach drei Minuten und speichern Sie sie für eine spätere Analyse.
Pipettieren Sie die Zellen aus dem Auslassende des LiDEP-Chips, indem Sie langsam 60 Mikroliter DEP-Puffer mit 0,5 % BSA in den Mikrokanal drücken und gleichzeitig den Auslass auffangen. Fahren Sie fort, bis sich wenig bis gar keine Zellen mehr im Mikrokanal befinden, und wiederholen Sie die DEP mit allen Frequenzen wie gezeigt. Die DEP-Antworten in Bezug auf die Geschwindigkeit der HMSCs und ihre Rentabilität wurden bestimmt.
Die Messungen der positiven DEP-Antworten bei fünf, 10 und 20 Spannungsspitzen oder VPP zeigten, dass sich die Zellen mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 0,025, 0,036 bzw. 0,051 Mikrometern pro Sekunde bewegten. Die Viabilitätsergebnisse der HMSCs nach dem Erleben der DEP-Kraft zeigten, dass die höheren Spannungen im Allgemeinen zu einer geringeren Zellviabilität führten, wobei 57 % der Zellen bei 20 VPP lebensfähig waren. Für diese Studie wurden weiße, gelbe, rote und blaue Elektroden ausgewählt, aber die Beleuchtung durch den LiDEP-Tiefenchip wurde durch die photoleitende Schicht beeinflusst, die eine rot-orange Farbe hatte.
Daher erschien die projizierte weiße Elektrode gelb mit einem weißen Inneren, die rote Elektrode orange mit einem roten Umriss und die blaue Elektrode hellgrün. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass Gelb und Weiß das stärkste DEP-Feld hatten, während Blau und Rot schwächer waren. Die DEP-Antworten von HMCs wurden mit LiDEP in drei Tiefenanalysatoren bei 10 VPP gemessen.
Bei LiDEP kam es zu einem Abfall der positiven DEP-Antwort von 30 Kilohertz auf 20 Megahertz. Mit den drei Analysatoren stiegen die Zellen im positiven DEP von 37 auf 255 Kilohertz und im positiven DEP von 1.772 Kilohertz auf 20 Megahertz ab. Zwei wichtige Komponenten bei dieser Methode sind eine starke Lichtquelle und eine solide elektrische Verbindung, um die Erzeugung des elektrischen Feldes und die Manipulation der Zellen zu gewährleisten.
Wir beobachteten, wie sich die Zellen als Reaktion auf virtuelle Elektroden drehten. Somit ist die Elektrorotation eine weitere Zellanalysemethode, die durchgeführt werden kann. Die Elektrorotation würde Aufschluss über die Heterogenität von HMSCs und seltene Subpopulationen geben.
