Este protocolo de dieletroforese induzida por luz ou LiDEP fornece um método passo-a-passo para a caracterização de células-tronco mesenquimais humanas. Este método pode ajudar a fornecer respostas sobre a heterogeneidade de amostras de células-tronco. A vantagem do LiDEP é a capacidade de fazer alterações em tempo real na configuração do eletrodo virtual em resposta à heterogeneidade de células-tronco, o que não é possível para os métodos tradicionais de DEP.
Um novo usuário desta técnica pode ter dificuldades em condensar a luz do projetor o suficiente no dispositivo microfluídico para fazer o eletrodo virtual. Aconselhamos reconfigurar a instalação até que ela funcione. Quem ajudará a demonstrar o procedimento será Zuri Rashad, estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, prepare o microcanal perfurando furos de quatro milímetros de diâmetro em uma fita dupla face a cerca de cinco a seis milímetros da borda da dimensão mais curta e centralizada entre os lados mais longos da fita. Usando um bisturi, corte duas linhas retas com três milímetros de distância através dos orifícios, garantindo que as folhas de proteção em ambas as faces da fita estejam ligadas durante todo o corte do microcanal. Marque todo o local com um marcador lavável, garantindo que os furos perfurados estejam alinhados com os furos perfurados na fita dupla face.
Estes dois orifícios serão utilizados como orifícios de entrada e saída do dispositivo microfluídico. Faça dois furos de três milímetros de diâmetro na lâmina de vidro ITO superior. Em seguida, na parte superior do vidro revestido ITO perfurado, coloque a borda longa da fita alinhando-se com a borda longa do vidro.
Remova um lado da película protetora da fita dupla face. Alinhe os orifícios da fita na corrediça de vidro ITO superior e pressione-os suavemente juntos, removendo as bolsas de ar, especialmente perto do microcanal. Remova a outra película protetora da fita dupla face.
Pressione a lâmina de vidro ITO revestida de molibdênio e silício amorfo que corresponde à borda da lâmina condutora de foto oposta ao lado de dois milímetros de folga com a borda da fita dupla face em direção ao centro da lâmina de vidro ITO superior. Dessa forma, existe uma ressaca entre o ITO e o slide ITO condutor de fotos. Pressione em uma superfície plana para garantir uma boa aderência e corte o excesso de fita nas laterais.
Para conectar o gerador de funções, aplique fita de cobre nas bordas da camada de vidro ITO e camada de vidro ITO revestida com fotocondução. Embrulhe a fita na lateral do ITO ou material fotocondutor da borda da fita dupla face até cerca de três centímetros no lado não revestido do substrato de vidro. Para garantir o sucesso da fabricação do dispositivo, use um altímetro para testar a leitura de resistência entre as lâminas revestidas de ambos os substratos de vidro e a fita de cobre que foi presa ao vidro.
Adicione 25 mililitros de água ultrapura a um tubo cônico de 50 mililitros contendo 4,25 gramas de sacarose e 0,15 gramas de glicose. Misture bem até que metade da sacarose e da glicose se dissolva e faça com água ultrapura até a marca de 50 mililitros. Em seguida, misture vigorosamente este tampão DEP até dissolver completamente.
Coloque 20 mililitros da solução preparada de sacarose e glicose em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicionar 0,1 gramas de albumina de soro bovino, BSA, no tubo. Vórtice bem até que toda a BSA se dissolva para obter uma concentração final de 0,5% BSA no tampão DEP.
Coloque uma vez 10 às seis células-tronco mesenquimais humanas ou HMSCs ou rim embrionário humano, HEK293 suspenso em um mililitro de meio de crescimento em um tubo de centrífuga de 10 mililitros. Centrífuga, as células HEK293 a 201 G por cinco minutos e os HMSCs a 290 G por 10 minutos. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante.
01 Ressuspenda suavemente as células em solução tampão DEP de um mililitro com BSA a 0,5%. Repetir a centrifugação mais duas vezes e ressuspender as células no tampão DEP com BSA a 0,5%. Prepare os itens de configuração experimental, como laptop, projetor, lente objetiva, microscópio digital e um gerador de funções para quantificar as respostas celulares ao LiDEP.
Posicione a lente objetiva de 10x, o chip LiDEP e o suporte na parte superior da lente do projetor. Use o laptop para projetar projeções de luz, como estrela, diamante, três linhas e oval e conecte o laptop ao projetor. Conecte o chip LiDEP ao gerador de funções para aplicar o campo elétrico CA.
Para observar as células que experimentam a força LiDEP, use um microscópio digital para obter imagens de gravação de NVIDIA. Após completar o setup, lave o microcanal com etanol a 70% e, em seguida, lave a solução BSA a 0,5% para remover o etanol nas células anteriores. Repita a descarga três vezes para garantir que a lavagem completa das células expostas anteriormente ao campo DEP responderão de forma diferente das células frescas e poderão interromper a coleta de dados.
Remova a solução BSA a 0,5% com uma pipeta. Em seguida, ajuste o gerador de função para a tensão e frequência desejadas. Adicione cuidadosamente 70 microlitros da suspensão de célula preparada no microcanal do dispositivo usando uma ponta de pipeta menor, inclinando-a ligeiramente no orifício em direção ao microcanal para evitar derramamento devido à finura do microcanal.
Limpe a solução de acesso com lenços de papel de uso único e descarte-os em resíduos de risco biológico. Em seguida, projete os círculos de eletrogeometria virtual desejados, diamantes, estrelas ou linhas paralelas no chip LiDEP. No software do microscópio digital, defina a duração do vídeo para três minutos.
Defina um temporizador de laboratório para dois minutos e 30 segundos. Uma vez que as células estão estacionárias no microcanal do chip LiDEP, pressione start no software do microscópio digital para iniciar o processo de gravação de vídeo. Após 10 segundos, pressione o botão On da saída do canal do gerador de função para aplicar o campo elétrico CA e pressione start para o temporizador.
Monitore o comportamento da DEP celular através do microscópio digital e evite tremores ou movimentos ao redor da configuração. Quando o temporizador disparar, pressione o botão On da saída do canal do gerador de função que desliga a saída do canal e o campo elétrico CA não é mais fornecido através dos eletrodos. Pare a gravação de vídeo após três minutos e salve-a para análise futura.
Pipetar as células para fora da extremidade de saída do chip LiDEP empurrando lentamente 60 microlitros de tampão DEP com 0,5% BSA para o microcanal e, simultaneamente, coletando a saída. Continue até que haja pouca ou nenhuma célula no microcanal e repita a DEP com todas as frequências demonstradas. Foram determinadas as respostas da DEP em termos de velocidade para os HMSCs e sua porcentagem de viabilidade.
As medidas das respostas positivas da DEP em cinco, 10, e 20 tensões pico a pico ou VPP mostraram que as células se moviam a uma velocidade média de 0,025, 0,036 e 0,051 micrômetros por segundo, respectivamente. Os achados de viabilidade dos HMSCs após experimentarem a força de DEP mostraram que as tensões mais altas geralmente resultaram em menor viabilidade celular, com 57% das células viáveis a 20 VPP. Eletrodos de cor branca, amarela, vermelha e azul foram escolhidos para este estudo, mas a iluminação através do chip de profundidade LiDEP foi afetada pela camada fotocondutora, que tinha uma cor laranja vermelha.
Assim, o eletrodo branco projetado apareceu amarelo com um interior branco, o eletrodo vermelho apareceu laranja com um contorno vermelho e o eletrodo azul apareceu verde claro. Esse fenômeno sugere que amarelo e branco tiveram o campo DEP mais forte, enquanto azul e vermelho foram mais fracos. As respostas DEP dos HMCs foram medidas com LiDEP em analisador de três profundidades a 10 VPP.
Com o LiDEP, houve um declínio na resposta DEP positiva de 30 kilohertz para 20 mega-hertz. A partir dos três analisadores, as células aumentaram na DEP positiva de 37 para 255 kilohertz e diminuíram na DEP positiva de 1.772 kilohertz para 20 mega-hertz. Dois componentes importantes neste método são uma fonte de luz forte e uma conexão elétrica sólida para garantir a produção do campo elétrico e a manipulação celular.
Observamos a rotação celular em resposta a eletrodos virtuais. Assim, a eletrorrotação é outro método de análise celular que pode ser realizado. A eletrorrotação forneceria informações sobre a heterogeneidade dos HMSCs e subpopulações raras.
