Este protocolo de dielectroforesis inducida por luz o LiDEP proporciona un método paso a paso para la caracterización de células madre mesenquimales humanas. Este método puede ayudar a proporcionar respuestas sobre la heterogeneidad de las muestras de células madre. La ventaja de LiDEP es la capacidad de realizar cambios en tiempo real en la configuración del electrodo virtual en respuesta a la heterogeneidad de células madre, lo que no es posible para los métodos DEP tradicionales.
Un nuevo usuario de esta técnica podría tener dificultades para condensar la luz del proyector lo suficiente en el dispositivo microfluídico para hacer el electrodo virtual. Aconsejamos volver a configurar la configuración hasta que funcione. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Zuri Rashad, un estudiante graduado de mi laboratorio.
Para comenzar, prepare el microcanal perforando agujeros de cuatro milímetros de diámetro en una cinta de doble cara a unos cinco a seis milímetros del borde de la dimensión más corta y centrada entre los lados más largos de la cinta. Con un bisturí, corte dos líneas rectas separadas tres milímetros a través de los orificios asegurándose de que las láminas protectoras en ambas caras de la cinta estén encendidas durante todo el corte de microcanales. Marque toda la ubicación con un marcador lavable que asegure que los orificios perforados se alineen con los orificios perforados en la cinta de doble cara.
Estos dos orificios se utilizarán como orificios de entrada y salida del dispositivo microfluídico. Perfore dos orificios de tres milímetros de diámetro en la corredera de vidrio ITO superior. A continuación, en la parte superior del vidrio recubierto ITO perforado, coloque el borde largo de la cinta alineado con el borde largo del vidrio.
Retire un lado de la película protectora de la cinta de doble cara. Alinee los orificios de la cinta en la parte superior del portaobjetos de vidrio ITO y presiónelos suavemente juntos eliminando las bolsas de aire, especialmente cerca del microcanal. Retire la otra película protectora de la cinta de doble cara.
Presione sobre la diapositiva de vidrio ITO recubierta de molibdeno y silicio amorfo que coincida con el borde de la diapositiva fotoconductora opuesta al lado de espacio libre de dos milímetros con el borde de la cinta de doble cara hacia el centro de la diapositiva de vidrio ITO superior. De esta manera, existe una resaca entre el ITO y la diapositiva ITO fotoconductora. Presione sobre una superficie plana para asegurar una buena adherencia y cortar el exceso de cinta en los lados.
Para conectar el generador de funciones, aplique cinta de cobre a los bordes de la capa de vidrio ITO y la capa de vidrio ITO recubierta fotoconductora. Envuelva la cinta en el lado del ITO o material fotoconductor desde el borde de la cinta de doble cara hasta unos tres centímetros en el lado no recubierto del sustrato de vidrio. Para garantizar una fabricación exitosa del dispositivo, use un altímetro para probar la lectura de resistencia entre los portaobjetos recubiertos de ambos sustratos de vidrio y la cinta de cobre que se adhirió al vidrio.
Agregue 25 mililitros de agua ultrapura a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 4.25 gramos de sacarosa y 0.15 gramos de glucosa. Mezclar bien hasta que la mitad de la sacarosa y la glucosa se disuelva y enrasar con agua ultrapura hasta la marca de 50 mililitros. Luego mezcle vigorosamente este tampón DEP hasta que se disuelva por completo.
Coloque 20 mililitros de la solución preparada de sacarosa y glucosa en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue 0.1 gramos de albúmina sérica bovina, BSA, en el tubo. Vortex bien hasta que todo el BSA se disuelva para obtener una concentración final de 0.5% BSA en el tampón DEP.
Coloque una vez 10 a las seis células madre mesenquimales humanas o HMSC o riñón embrionario humano, HEK293 suspendido en un mililitro de medio de crecimiento en un tubo de centrífuga de 10 mililitros. Centrífuga, las celdas HEK293 a 201 G durante cinco minutos y las HMSC a 290 G durante 10 minutos. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante.
01 Y resuspenda suavemente las células en una solución tampón DEP de mililitro con BSA al 0,5%. Repita la centrifugación dos veces más y resuspenda las células en el tampón DEP con BSA al 0,5%. Prepare los elementos de configuración experimentales, como una computadora portátil, un proyector, una lente objetiva, un microscopio digital y un generador de funciones para cuantificar las respuestas celulares a LiDEP.
Coloque la lente del objetivo 10x, el chip LiDEP y el soporte en la parte superior de la lente del proyector. Utilice el portátil para diseñar proyecciones de luz como estrella, diamante, tres líneas y óvalo y conecte el portátil al proyector. Conecte el chip LiDEP al generador de funciones para aplicar el campo eléctrico de CA.
Para observar las células que experimentan la fuerza LiDEP, utilice un microscopio digital para obtener imágenes de la grabación de NVIDIA. Después de completar la configuración, enjuague el microcanal con etanol al 70% y luego enjuague la solución BSA al 0,5% para eliminar el etanol en las celdas anteriores. Repita el lavado tres veces para asegurarse de que se elimine por completo, ya que las células previamente expuestas al campo DEP responderán de manera diferente a las células nuevas y pueden interrumpir la recopilación de datos.
Retire la solución BSA al 0,5% con una pipeta. A continuación, ajuste el generador de funciones al voltaje y la frecuencia deseados. Agregue cuidadosamente 70 microlitros de la suspensión celular preparada en el microcanal del dispositivo con una punta de pipeta más pequeña, inclinándola ligeramente en el orificio hacia el microcanal para evitar derrames debido a la delgadez del microcanal.
Limpie la solución de acceso con toallitas de papel de un solo uso y deséchelas en residuos de riesgo biológico. Luego, proyecte los círculos de geometría eléctrica virtual deseados, diamantes, estrellas o líneas paralelas en el chip LiDEP. En el software del microscopio digital, ajuste la duración del video a tres minutos.
Establezca un temporizador de laboratorio en dos minutos y 30 segundos. Una vez que las celdas estén estacionarias en el microcanal del chip LiDEP, presione inicio en el software del microscopio digital para comenzar el proceso de grabación de video. Después de 10 segundos, presione el botón On de la salida del canal del generador de funciones para aplicar el campo eléctrico de CA y presione inicio para el temporizador.
Monitoree el comportamiento del DEP celular a través del microscopio digital y evite temblores o movimientos alrededor de la configuración. Una vez que el temporizador se apaga, presione el botón On de la salida del canal del generador de funciones que apaga la salida del canal y el campo eléctrico de CA ya no se suministra a través de los electrodos. Detenga la grabación de video después de tres minutos y guárdela para análisis futuros.
Pipetea las células fuera del extremo de salida del chip LiDEP empujando lentamente 60 microlitros de tampón DEP con 0.5% BSA en el microcanal y recolectando simultáneamente la salida. Continúe hasta que haya poca o ninguna célula en el microcanal y repita el DEP con todas las frecuencias como se demuestra. Se determinaron las respuestas DEP en términos de velocidad para los HMSC y su porcentaje de viabilidad.
Las mediciones de las respuestas DEP positivas a cinco, 10, y 20 voltaje pico a pico o VPP mostraron que las células se movían a una velocidad promedio de 0.025, 0.036 y 0.051 micrómetros por segundo, respectivamente. Los hallazgos de viabilidad de los HMSC después de experimentar la fuerza DEP mostraron que los voltajes más altos generalmente resultaron en una menor viabilidad celular con el 57% de las celdas viables a 20 VPP. Para este estudio se eligieron electrodos de color blanco, amarillo, rojo y azul, pero la iluminación a través del chip de profundidad LiDEP se vio afectada por la capa fotoconductora, que tenía un color rojo naranja.
Por lo tanto, el electrodo blanco proyectado apareció amarillo con un interior blanco, el electrodo rojo apareció naranja con un contorno rojo y el electrodo azul apareció verde claro. Este fenómeno sugiere que el amarillo y el blanco tenían el campo DEP más fuerte, mientras que el azul y el rojo eran más débiles. Las respuestas DEP de las HMC se midieron con LiDEP en un analizador de tres profundidades a 10 VPP.
Con LiDEP, hubo una disminución en la respuesta positiva de DEP de 30 kilohercios a 20 megahercios. De los tres analizadores, las células aumentaron en el DEP positivo de 37 a 255 kilohercios y disminuyeron en DEP positivo de 1.772 kilohercios a 20 megahercios. Dos componentes importantes en este método son una fuente de luz fuerte y una conexión eléctrica sólida para garantizar la producción del campo eléctrico y la manipulación de la celda.
Observamos el giro celular en respuesta a electrodos virtuales. Por lo tanto, la electro rotación es otro método de análisis celular que se puede realizar. La electrorrotación proporcionaría información sobre la heterogeneidad de las HMSC y las subpoblaciones raras.
