Увеличение продолжительности жизни нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа спонтанной смерти in vitro

Наш протокол предоставляет коктейльную среду для продления продолжительности жизни нейтрофилов до более чем пяти дней без ущерба для функций нейтрофилов. Он также предлагает надежный диализ in vitro для нейтрофилов. Лечение CLON-G расширяет возможности сохранения, транспортировки и манипулирования генами нейтрофилов, что может ускорить исследования в сообществе нейтрофилов.

Для начала приготовьте основную среду, добавив RPMI 1640 FBS и ручку-стрептококк в 50-миллилитровую пробирку. Одновременно размораживают на льду все стоковые растворы компонентов КЛОН-Г. Затем разбавляют HSP 70 и 200 мкг на миллилитр G-CSF в основной среде.

Перелейте 976 микролитров основной среды в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. К этому добавляют компоненты CLON-G для получения одного миллилитра среды 2x CLON-G, как описано в рукописи. Затем готовят культуру нейтрофилов, суспендируя изолированные нейтрофилы мыши в основной среде.

Добавьте среду CLON-G, а затем основную среду к 24 луночным нетканевым культивируемым пластинам. Затем добавьте 100 микролитров подготовленной клеточной суспензии и аккуратно пипетите три-четыре раза. Инкубируйте культуральную пластину при температуре 37 градусов Цельсия с 5% запасом углекислого газа.

Окрашивают культивируемые нейтрофилы цитоспином и анализируют их с помощью светового микроскопа. Для анализа проточной цитометрии добавьте один миллилитр клеточной среды в культуру нейтрофильных клеток, выращенную за ночь. Смешайте среду для культивирования клеток, аккуратно пипетируя ее пять-семь раз, и перенесите 100 микролитров этой смеси в проточную цитометрическую пробирку в желаемые моменты времени.

Одновременно вихревают счетные шарики и пипетируют 10 микролитров раствора шариков в ту же проточную проточную проточную пробирку, содержащую клеточную среду. Добавьте в эту проточную пробирку 10 микролитров заранее приготовленной смеси для окрашивания и выдержите пять минут в холодильнике в темноте. Затем добавьте 100 микролитров физиологического раствора в пробирку и хорошо перемешайте для равномерного распределения счетных шариков и ячеек.

Наконец, выполните проточный цитометрический анализ клеточной суспензии, как описано в текстовой рукописи. Для анализа флуоресцентных изображений добавьте два миллилитра клеточной суспензии на конфокальную пластину и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Тем временем растворите один грамм хлорида кальция в 45 миллилитрах физиологического раствора и отфильтруйте его с помощью фильтрующего устройства размером 0,2 микрометра.

Аккуратно снимите конфокальную пластину в нужный момент времени. Окрашивайте клетки 10 микролитрами FITC-Annexin-V, PI и хлорида кальция в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа сделайте снимки с помощью нужных каналов.

В настоящем исследовании морфология нейтрофилов не была затронута в среде CLON-G даже через пять дней. Кроме того, факсимильные фенотипы продемонстрировали интактные клетки после лечения. Анализ проточной цитометрии показал положительную популяцию необработанных нейтрофилов в Annexin-V, и потеря популяции может быть связана с этилендиаминтетрауксусной кислотой в клеточной среде.

Однако жизнеспособность нейтрофилов, обработанных CLON-G, через 24 часа составляла примерно более 90%Анализы флуоресцентных изображений также подтвердили жизнеспособность клеток нейтрофилов, обработанных CLON-G. Нейтрофилы, культивируемые в основной среде в течение 24 часов, показали надутые клетки, и потеря этих клеток могла быть результатом встряхивания или пипетирования конфокальной пластинки. Концентрации и эффекты соединений CLON-G могут существенно повлиять на тесты на нейтрофилы.

Если это вообще возможно, избегайте их модуляции. Исследования нейтрофилов трудоемки, дороги и крайне ограничены в клиническом применении из-за их короткого срока службы. Этот метод частично преодолевает эти препятствия.