Подготовка образцов криогенной системы сталкивается с проблемами, которые могут ограничить ее эффективность, в частности, с неравномерным распределением частиц. Эта проблема часто приводит к плохому разрешению и снижению точности в новых сконструированных белковых структурах. Для преодоления неравномерного распределения частиц используются различные экспериментальные подходы, включая добавление в образец детергентов или мембранных имитаторов, модификацию пленки-опоры сетки и наклон определенного столика во время сбора данных.
В этом протоколе анализируется простой практический метод решения проблемы неравномерного распределения частиц за счет оптимизации пробоподготовки, что является нашим ориентиром для исследователей для эффективной иллюстрации структур макромолекул с помощью криогена. Для начала соберите объединенные белковые фракции, содержащие малый белок теплового шока MJ 16,5. Используйте центробежные фильтры с отсечкой молекулярной массы 50 килодальтон для концентрации фракций при четырех градусах Цельсия примерно до 65 миллиграммов.
После концентрирования образец центрифугирует при 16 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия для удаления заполнителей. Аликвотировать 50 микролитров надосадочной жидкости в тонкостенные ПЦР-пробирки объемом 0,2 миллилитров. Для просвечивающей электронной микроскопии разморозьте две замороженные белковые пробирки на льду.
После размораживания несколько раз прокрутите тюбиком, чтобы перемешать. Затем центрифугируйте белковый раствор при 16 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия для удаления агрегатов. Далее вводят надосадочную жидкость в колонку эксклюзионной хроматографии и собирают фракции элюирования 0,5 миллилитров.
Соберите элуцианские дроби, соответствующие пику, демонстрирующие самое высокое поглощение ультрафиолета на 280 нанометрах. Для буферной замены ножницами разрежьте диализную мембрану на кусочки размером 30 на 30 миллиметров. Инкубируйте кусочки в дистиллированной воде или буферных растворах, чтобы сбалансировать их.
Далее добавьте 55 микролитров белкового раствора в камеру с 50 микролитрами кнопок микродиализа. Держите диализную мембрану вертикально с помощью щипцов и осторожно коснитесь одного края мембраны папиросной бумагой, чтобы слить лишнюю жидкость. Тщательно прикройте кнопку микродиализа мембраной.
Поместите уплотнительное кольцо поверх диализной мембраны и аккуратно скатайте его в углубление на краю кнопки. Погрузите каждую кнопку диализа в отдельную мензурку, содержащую буфер назначения стороной мембраны вверх. С помощью шприца с тонкой иглой осторожно проколите мембрану и извлеките белковый раствор из камеры микродиализа.
Загрузите пять микролитров образца в концентрации от 20 до 120 нанограмм на миллилитр на решетку тлеющего разряда. Приготовьте три капли воды по 50 микролитров каждая на листе парафиновой пленки. Потрите поверхность сетки о капли воды, чтобы смыть образец.
Теперь загрузите в сетку пять микролитров отфильтрованного 1%-ного раствора ацетата писсуара и немедленно удалите раствор ацетата писсуара. Загрузите в сетку еще пять микролитров раствора ацетата писсуара. Осторожно коснитесь стороны сетки пинцетом фильтровальной бумагой, чтобы удалить излишки раствора для окрашивания, и дайте сетке высохнуть.
Установите пинцет и газоразрядную решетку в сборе на прибор. Затем загрузите четыре микролитра образца на углеродную сторону сетки. Запустите процесс погружной заморозки.
Чтобы подготовить сетки к загрузке на просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ), сначала поместите сетчатую коробку, содержащую остеклованные сетки, в станцию автоматической сборки решетки и открутите крышку сетчатой коробки, содержащей остеклованные сетки. Поместите кольцо автоматической решетки в специально отведенное место для выреза на сборочной станции. Осторожно переместите остекленную сетку из сетчатого короба и вставьте ее внутрь кольца авторешетки.
Теперь выровняйте диск так, чтобы круглое отверстие располагалось поверх кольца автоматической решетки и сетки в сборе. Чтобы закрепить сетку в кольце автоматической решетки, поместите инструмент для вставки зажима C на верхнюю часть сетки и слегка надавите, чтобы закрепить зажим C внутри. Поверните диск назад и переместите собранные решетки в ящик для хранения с автоматической решеткой.
Соберите станцию загрузки кассеты и охладите ее жидким азотом. Поместите накопительный ящик с автоматической электросетью на загрузочной станции. Переместите сборку сетки из коробки для хранения авторешетки в кассету.
С помощью рукоятки поместите кассету в капсюль автозаряжателя. Проверьте штифт в автомате заряжания, чтобы убедиться в его свободном перемещении и убедиться, что он не замерз. Накопление частиц в массивах наблюдалось на всех испытуемых сетках независимо от буферных условий или модификаций поверхностного заряда.
Более высокая концентрация белка в сочетании с отрицательно заряженными сетками в девяти миллимолярах мобстресса, 50 миллимолярах хлорида натрия и 0,1 миллимоляра буфера ЭДТА привела к желаемому распределению одиночных частиц в отверстиях сетки, уменьшая образование белкового массива. Это оптимизированное условие привело к высокому значению конического отношения площади FSC 0,80 и значению SCF 0,859, что подтверждает равномерное распределение частиц.
