Функции белков зависят от температуры и оптимальны при температуре. Этот протокол обеспечивает способ решения белковых структур при более высоких температурах. Этот подход может обеспечить функционально значимые структуры и улучшить понимание температурной зависимости белковых структур.
Демонстрировать процедуру будет Юань-Чи Чанг, менеджер academia Sinica Cryo EM. Начните с того, что сделайте односантиметровое отверстие в 50-миллиметровой центрифужной трубке на ее закрытом конце. Поместите трубку в камеру витрификационного аппарата на выходе ультразвуковой воды.
Установите температуру витрификационного аппарата до заданной температуры, и позвольте камере аппарата витрификации достигать 55 градусов Цельсия и 100% относительной влажности. Дайте ему постоять не менее получаса, чтобы стабилизировать условия перед началом эксперимента. Поместите водяную баню на конфорку и установите конфорку на нужную температуру.
Проверьте с помощью термометра, чтобы убедиться, что вода достигает 55 градусов по Цельсию. Инкубируйте образец на водяной бане и разогрейте наконечник пипетки на краю конфорки в течение двух минут или дольше перед экспериментом по промоканию. Тлеющий разряд дырявой углеродной сетки при 25 миллиампер в течение 30 секунд.
Поместите фильтровальную бумагу для витрификации в камеру витрификационного аппарата не ранее, чем за пять минут до эксперимента по промоканию. Инкубируйте пинцет сеткой в витрификационном аппарате в течение двух минут или дольше. Постройте этановый контейнер с этаном в соответствии со стандартными процедурами, гарантируя, что этан не переполнится.
Используйте пипетку, чтобы нанести семь-девять микролитров образца на сетку. Затем подождите одну-две секунды, промокните от одной до полутора секунд и быстро погрузите образец в жидкий этан. Перенесите сетку из жидкого этана в криобокс, хранящийся в жидком азоте.
Обрежьте сетки и выгрузите их, чтобы получить электронный микроскоп или прибор Cryo EM. Используйте экран отображения прибора Cryo EM и функцию низкой дозы программного обеспечения для скрининга состояния льда на сетке и распределения образца по сетке. Если качество полученной сетки не очень хорошее, повторите процесс подготовки сетки с различными условиями, такими как время ожидания, время промокания и т. Д.
Если качество полученной сетки хорошее, повторите те же шаги, чтобы сделать сетки при другой температуре. Перенесите сетки хорошего качества на прибор Cryo EM высокого разрешения. Осуществлять сбор и анализ данных в соответствии с установленными процедурами.
В случае успешной сетки образуется градиент льда с более толстым льдом в левом верхнем углу сетки и более тонким льдом в правом нижнем углу. Синие и зеленые квадраты, пригодные для сбора данных, были замечены в успешной сетке. Яркий контраст наблюдался в другой сетке.
Указывает на тонкий слой, льда или отсутствие льда. Было признано, что только два квадрата подходят для сбора данных во второй сетке. Одна из решеток состояла из льда в основном в кристаллиновой форме, что было непригодно для сбора данных.
С другой стороны, другая сетка показала, что слой льда был в основном в аморфном состоянии, подходящем для сбора данных. Подготовка в качестве контейнера и других должна быть завершена в соответствии с временным моментом. Контроль времени и быстрое и точное завершение эксперимента являются наиболее важными.
В зависимости от результатов, полученных с использованием этого протокола, исследователю, возможно, придется быть более осторожным в настройке простых условий.
