Наши исследования в целом сосредоточены на разработке оптогенетических методов, которые обеспечивают точный пространственно-временной контроль активности белка с помощью света. Мы разрабатываем регулируемые светом домены, называемые lightR, для аллостерической регуляции, что позволяет нам изучать, как пространственно-временная активность белка влияет на клеточную сигнализацию и функции, помогая в доклиническом моделировании заболеваний и разработке терапии. Оптогенетика сталкивается с рядом проблем, включая достижение точного и обратимого контроля активности белка-мишени и точную имитацию эндогенной сигнальной кинетики.
Ключевыми проблемами являются предотвращение нежелательной активации, обеспечение целенаправленной субклеточной активации и управление фототоксичностью для сохранения жизнеспособности клеток. Кроме того, разработка универсально совместимых и надежных инструментов имеет решающее значение для повышения универсальности и воспроизводимости в приложениях. Наш протокол для разработки инструментов lightR уникальным образом сочетает в себе множество передовых функций в одной системе, включая аллостерическую регуляцию, высокую чувствительность, пространственное разрешение, жесткий временной контроль и точную специфичность сигнализации.
Эта интеграция обеспечивает настраиваемость для различных белков-мишеней, устраняя пробелы в других методах, которым может не хватать одной или нескольких из этих критически важных возможностей. Мы заинтересованы в определении ключевых сигнальных и структурных процессов, регулирующих миграцию клеток. Мы стремимся использовать нашу оптогенетическую технологию для анализа регуляции миграции эндотелиальных клеток и взаимодействий.
Понять, как ремоделирование внеклеточного матрикса опосредуется эндотелиальными клетками, и определить, как нарушение регуляции этих процессов способствует развитию заболевания. Для биохимического анализа lightR-киназ накладку один раз по 10 в степени шести клеток lin XE на 3,5 сантиметровую чашку для клеточной культуры для каждой опытной группы, инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение 16-18 часов. На следующий день трансфектируйте клетки выбранной конструкцией ДНК с использованием соответствующего реагента для трансфекции.
Накройте тарелку алюминиевой фольгой и верните ее в инкубатор. После 16-18 часов трансфекции поместите 465-нанометровую светодиодную панельную лампу внутрь инкубатора для тканевых культур. Расположите перфорированную панель из плексигласа на высоте 10 сантиметров над лампой, чтобы добиться освещенности в три милливатта на квадратный сантиметр.
Используйте непрерывное освещение в элементах, экспрессирующих LightR-Src и D388 R-LightR-Src. Включайте и выключайте светодиодную панель вручную для управления подсветкой. По окончании экспериментальных временных точек соберите клетки под безопасным красным светом, аспирируйте среду и промойте клетки холодным PBS.
Глобальное освещение клеток lin XE сконструированным LightR-Src в течение 60 минут показывает фосфорилирование субстратов Src, эндогенного паксиллина и клеток p130Cas, экспрессирующих каталитический неактивный мутант D388 RLightR-Src, не проявляет фосфорилирования субстратов Src при глобальном освещении. Для начала нанесите в пласт два раза по 10 в степени пяти хела-клеток на 35-миллиметровую чашку для культуры тканей в среде для клеточных культур. Инкубируйте клетки в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.
После того, как клетки прикрепятся и достигнут конфлюенции от 60 до 70%, сотрансфектируйте клетки hella с данной смесью. Накройте тарелку алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить случайное освещение ячеек. Затем инкубируйте клетки в течение 16-18 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Далее поместите закрытые стаканы диаметром 25 миллиметров и толщиной 0,17 миллиметра в камеру с шестью лунками. Покройте три круглые стеклянные крышки пятью миллиграммами на литр фибронектина в PBS и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Затем промойте чехол PBS через 16-18 часов после трансфекции.
Соберите трансфицированные клетки хела в безопасном красном свете, затем сыграйте примерно один раз по 10 в степени пяти трансфицированных хела на каждую крышку под безопасным красным светом. Накройте планшет алюминиевой фольгой и инкубируйте в среде для клеточных культур в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Далее подогрейте подготовленный носитель изображения и минеральное масло до 37 градусов Цельсия.
Затем промойте крышки, содержащие клетки, PBS два раза. После окрашивания и промывки клеток осторожно поместите крышку в камеру для визуализации живых клеток. Добавьте в камеру один миллилитр среды для визуализации L15.
Добавьте в среду один миллилитр предварительно подогретого минерального масла, чтобы предотвратить испарение во время визуализации. Держите камеру защищенной от света при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока она не будет готова к съемке. Поместите камеру на предметный столик микроскопа, нагретый до 37 градусов Цельсия.
Выберите одну ячейку, выражающую как быструю вишню LightR-Src, так и Src IRFP. Выберите определенные области интереса в ячейке для освещения. Для этого исследования выберите небольшую область на периферии выбранной клетки.
Визуализируйте выбранную ячейку каждую минуту в течение 20 минут в базальном состоянии до освещения. Продолжайте визуализацию в течение 50 минут, освещая локально, а затем через 20 минут после активации в общей сложности 90 минут. После создания образа, сохраните фильмы в формате файла tif stack для анализа.
Глобальное освещение hela-клеток привело к локализации быстрого LightR-Src в фокальных спайках, которые были обращены вспять после выключения синего света. Это освещение также вызвало значительное увеличение распространения клеток, которое прекратилось, как только синий свет был выключен. Каталитический неактивный мутант D388 R-LightR-Src не показал распространения клеток.
Локализованное освещение hela-клеток, экспрессирующих быстрый LightR-Src, приводило к накоплению конструкции в очаговых спайках, что приводило к локализованным выпячиванию мембран с 50-минутным освещением. В течение 20 минут темноты после освещения не наблюдалось дальнейшего увеличения площади. Fast LightR-Src постепенно исчезал из фокальных спаек в темной фазе.
Центроид клетки сместился в сторону освещенной области. После быстрой активации LightR-Src, указывающей на направленное движение клеток.
