Nuestra investigación general se centra en el desarrollo de métodos optogenéticos que logren un control espacio-temporal preciso de la actividad de las proteínas mediante la luz. Diseñamos dominios regulables por luz llamados lightR para la regulación alostérica, lo que nos permite estudiar cómo la actividad de las proteínas controlada espacio-temporalmente afecta la señalización y las funciones celulares, lo que ayuda en el modelado preclínico de enfermedades y el desarrollo de terapias. La optogenética se enfrenta a varios desafíos, entre ellos lograr un control preciso y reversible de la actividad de la proteína diana e imitar con precisión la cinética de señalización endógena.
Las cuestiones clave son la prevención de la activación no deseada, la activación subcelular dirigida y la gestión de la fototoxicidad para preservar la viabilidad celular. Además, el desarrollo de herramientas robustas y universalmente compatibles es crucial para mejorar la versatilidad y la reproducibilidad de las aplicaciones. Nuestro protocolo para herramientas de ingeniería lightR combina de manera única múltiples funciones avanzadas en un solo sistema, incluida la regulación alostérica, la alta sensibilidad, la resolución espacial, el control temporal estricto y la especificidad de señalización precisa.
Esta integración permite la sintonización a través de diversas proteínas objetivo, abordando las brechas en otros métodos que pueden carecer de una o más de estas capacidades críticas. Estamos interesados en definir los procesos estructurales y de señalización clave que regulan la migración celular. Nuestro objetivo es utilizar nuestra tecnología optogenética para diseccionar las regulaciones de la migración y las interacciones de las células endoteliales.
Comprender cómo la remodelación de la matriz extracelular está mediada por las células endoteliales y determinar cómo la desregulación de estos procesos contribuye al desarrollo de la enfermedad. Para el análisis bioquímico de la placa de quinasas lightR una vez 10 a la potencia de seis células lin XE para una placa de cultivo celular de 3,5 centímetros para cada grupo experimental, incube las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 16 a 18 horas. Al día siguiente, transfecte las células con la construcción de ADN seleccionada utilizando un reactivo de transfección adecuado.
Cubra el plato con papel de aluminio y devuélvalo a la incubadora. Después de 16 a 18 horas de transfección, coloque un sistema de lámpara de panel LED de 465 nanómetros dentro de la incubadora de cultivo de tejidos. Coloque un panel de plexiglás perforado a 10 centímetros por encima de la lámpara para lograr una iluminación de tres milivatios por centímetro cuadrado.
Utilice la iluminación continua en las celdas que expresan LightR-Src y D388 R-LightR-Src. Encienda y apague el panel LED manualmente para controlar la iluminación. Al final de los puntos de tiempo experimentales, recoja las células bajo luz roja segura, aspire el medio y lave las células con PBS frío.
La iluminación global de las células lin XE con LightR-Src diseñado durante 60 minutos muestra la fosforilación de los sustratos Src, la paxilina endógena y las células p130Cas que expresan el mutante catalítico inactivo D388 RLightR-Src no muestra fosforilación de los sustratos Src en la iluminación global. Para empezar, placa dos veces 10 a la potencia de cinco células hela por placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros en medios de cultivo celular. Incubar las células durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Una vez que las células se hayan unido y hayan alcanzado un 60 a 70% de confluencia, cotransfecte las células del infierno con la mezcla dada. Cubra el plato con papel de aluminio para evitar la iluminación accidental de las celdas. Luego incube las células durante 16 a 18 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
A continuación, coloque vidrios cubiertos con un diámetro de 25 milímetros y un grosor de 0,17 milímetros en una cámara de placa de seis pocillos. Cubra tres cubreobjetos de vidrio redondos con cinco miligramos por litro de fibronectina en PBS e incube a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, enjuague los cubreobjetos con PBS de 16 a 18 horas después de la transfección.
Recoja las células hela transfectadas en una luz roja segura, luego reproduzca aproximadamente una vez 10 a la potencia de cinco células hela transfectadas en cada cubreobjetos bajo una luz roja segura. Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar en medios de cultivo celular durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, caliente el medio de imagen preparado y el aceite mineral a 37 grados centígrados.
A continuación, lave dos veces las cubrebotellas que contienen las células con PBS. Después de teñir y lavar las células, coloque con cuidado el cubreobjetos en una cámara de imágenes de células vivas. Agregue un mililitro de medio de imagen L15 a la cámara.
Agregue un mililitro de aceite mineral precalentado al medio para evitar la evaporación durante la toma de imágenes. Mantenga la cámara protegida de la luz a 37 grados centígrados hasta que esté lista para tomar imágenes. Coloque la cámara en una platina de microscopio precalentada a 37 grados centígrados.
Seleccione una sola celda que exprese una cereza LightR-Src rápida y Src un IRFP. Seleccione regiones específicas de interés dentro de la celda para iluminar. Para este estudio, elija un área pequeña en la periferia de la celda seleccionada.
Obtenga una imagen de la celda seleccionada cada minuto durante 20 minutos en el estado basal antes de la iluminación. Continúe con la obtención de imágenes durante 50 minutos mientras se ilumina localmente, seguido de 20 minutos después de la activación para un total de 90 minutos. Después de la creación de imágenes, guarde las películas en formato de archivo de pila tif para su análisis.
La iluminación global de las células hela condujo a la localización de las adherencias rápidas de LightR-Src a focales, que se invirtieron una vez que se apagó la luz azul. Esta iluminación también provocó un aumento significativo en la dispersión de las células, que se detuvo una vez que se apagó la luz azul. El mutante catalítico inactivo D388 R-LightR-Src no mostró diseminación celular.
La iluminación localizada de las células hela que expresan LightR-Src rápido dio lugar a la acumulación de la construcción en adherencias focales, lo que dio lugar a protuberancias localizadas de la membrana con una iluminación de 50 minutos. No se observó más ganancia de área en la oscuridad de 20 minutos después de la iluminación. Fast LightR-Src desapareció gradualmente de las adherencias focales en la fase oscura.
El centroide de la célula se desplazó hacia la región iluminada. Después de una rápida activación de LightR-Src, que indica un movimiento celular dirigido.
