Nossa pesquisa geral se concentra no desenvolvimento de métodos optogenéticos que alcançam o controle espaço-temporal preciso da atividade da proteína pela luz. Projetamos domínios reguláveis por luz chamados lightR para regulação alostérica, permitindo-nos estudar como a atividade proteica controlada espaço-temporalmente afeta a sinalização e as funções celulares, auxiliando na modelagem pré-clínica de doenças e no desenvolvimento de terapias. A optogenética enfrenta vários desafios, incluindo alcançar um controle preciso e reversível da atividade da proteína-alvo e imitar com precisão a cinética de sinalização endógena.
As principais questões são prevenir a ativação indesejada, permitir a ativação subcelular direcionada e gerenciar a fototoxicidade para preservar a viabilidade celular. Além disso, o desenvolvimento de ferramentas robustas e universalmente compatíveis é crucial para melhorar a versatilidade e a reprodutibilidade em aplicações. Nosso protocolo para ferramentas lightR de engenharia combina de forma única vários recursos avançados em um único sistema, incluindo regulação alostérica, alta sensibilidade, resolução espacial, controle temporal rígido e especificidade de sinalização precisa.
Essa integração permite a sintonia entre diversas proteínas-alvo, abordando as lacunas em outros métodos que podem não ter uma ou mais dessas capacidades críticas. Estamos interessados em definir os principais processos estruturais e de sinalização que regulam a migração celular. Nosso objetivo é usar nossa tecnologia optogenética para dissecar os regulamentos de migração e interações de células endoteliais.
Entenda como a remodelação da matriz extracelular é mediada pelas células endoteliais e determine como a desregulação desses processos contribui para o desenvolvimento da doença. Para análise bioquímica da placa de quinases lightR uma vez 10 elevado à potência de seis células lin XE para placa de cultura de células de 3,5 centímetros para cada grupo experimental, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 16 a 18 horas. No dia seguinte, transfecte as células com a construção de DNA selecionada usando um reagente de transfecção apropriado.
Cubra o prato com papel alumínio e devolva-o à incubadora. Após 16 a 18 horas de transfecção, coloque um sistema de lâmpada de painel LED de 465 nanômetros dentro da incubadora de cultura de tecidos. Posicione um painel de plexiglass perfurado 10 centímetros acima da lâmpada para obter uma iluminação de três miliwatts por centímetro quadrado.
Use iluminação contínua em células que expressam LightR-Src e D388 R-LightR-Src. Ligue e desligue o painel de LED manualmente para controlar a iluminação. No final dos pontos de tempo experimentais, colher as células sob luz vermelha segura, aspirar o meio e lavar as células com PBS frio.
A iluminação global de células lin XE com LightR-Src projetado por 60 minutos mostra fosforilação de substratos Src, paxilina endógena e células p130Cas expressando o mutante D388 RLightR-Src catalítico inativo não mostra fosforilação de substratos Src na iluminação global. Para começar, coloque duas vezes 10 elevado a cinco células hela por placa de cultura de tecidos de 35 milímetros em meios de cultura de células. Incube as células por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Uma vez que as células tenham se ligado e atingido 60 a 70% de confluência, cotransfecte as células hella com a mistura dada. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a iluminação acidental das células. Em seguida, incube as células por 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, coloque os vidros cobertos com um diâmetro de 25 milímetros e uma espessura de 0,17 milímetros em uma câmara de placa de seis poços. Cubra três lamínulas redondas de vidro com cinco miligramas por litro de fibronectina em PBS e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, enxágue as lamínulas com PBS 16 a 18 horas após a transfecção.
Colete as células hela transfectadas em luz vermelha segura e, em seguida, jogue aproximadamente uma vez 10 elevado a cinco células hela transfectadas em cada lamínula sob luz vermelha segura. Cubra a placa com papel alumínio e incube em meios de cultura de células por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, aqueça o meio de imagem preparado e o óleo mineral a 37 graus Celsius.
Em seguida, lave as lamínulas contendo as células com PBS duas vezes. Depois de corar e lavar as células, coloque cuidadosamente a lamínula em uma câmara de imagem de células vivas. Adicione um mililitro de meio de imagem L15 à câmara.
Adicione um mililitro de óleo mineral pré-aquecido ao meio para evitar a evaporação durante a imagem. Mantenha a câmara protegida da luz a 37 graus Celsius até que esteja pronta para a imagem. Coloque a câmara em um microscópio pré-aquecido a 37 graus Celsius.
Selecione uma única célula que expresse a cereja rápida LightR-Src e Src um IRFP. Selecione regiões específicas de interesse dentro da célula para iluminar. Para este estudo, escolha uma pequena área na periferia da célula selecionada.
Crie imagens da célula selecionada a cada minuto durante 20 minutos no estado basal antes da iluminação. Continue a imagem por 50 minutos enquanto ilumina localmente, seguido de 20 minutos após a ativação por um total de 90 minutos. Após a geração de imagens, salve os filmes no formato de arquivo de pilha tif para análise.
A iluminação global das células hela levou à localização do rápido LightR-Src em aderências focais, que foram revertidas assim que a luz azul foi desligada. Essa iluminação também causou um aumento significativo na propagação celular, que parou quando a luz azul foi desligada. O mutante D388 R-LightR-Src catalítico inativo não mostrou disseminação celular.
A iluminação localizada de células hela expressando LightR-Src rápido resultou no acúmulo da construção em aderências focais, levando a saliências de membrana localizadas com iluminação de 50 minutos. Nenhum ganho de área adicional foi observado no escuro de 20 minutos após a iluminação. Fast LightR-Src desapareceu gradualmente das aderências focais na fase escura.
O centróide celular se deslocou em direção à região iluminada. Após ativação rápida do LightR-Src, indicando movimento celular direcionado.
