В нашем исследовании используется модель рака почки на чипе для изучения взаимодействия между здоровыми и раковыми клетками почек. Эта система помогает нам воспроизводить состояние in viva, что позволяет нам изучать вызванные опухолью изменения экспрессии генов, воспаления и метаболизма. Он также дает очень четкое представление о прогрессировании рака почки, а также о его влиянии на окружающие здоровые ткани.
Усовершенствованная система лечения рака почки на чипе использует множество подходов, таких как микрофлюидика, 3D-биопечать, визуализация с высоким разрешением, биосенсоры в реальном времени, секвенирование РНК и скрининг CRISPR. Эти технологии позволяют нам создать действительно точную симуляцию состояния почек in viva, что позволяет нам изучать клеточные реакции и изменения экспрессии генов. Достижение воспроизводимости в микрофлюидных экспериментах — это очень сложная задача.
Технические проблемы, такие как точная работа с жидкостями, могут привести к изменчивости результатов. Кроме того, колебания скорости потока и условия окружающей среды в сложных протоколах еще больше влияют на стабильные результаты. Наше предстоящее исследование будет сосредоточено на выявлении сигнатур микроРНК, связанных с прогрессированием рака почки, и оценке их потенциала в качестве биомаркеров заболевания.
Для начала спроектируйте необходимую камеру, состоящую из четырех параллельных отсеков, с помощью программного обеспечения для автоматизированного проектирования. Камера должна содержать два клеточных отсека, один матричный отсек и соединительный канал. Для 3D-печати камеры расплавьте биопластиковую нить, в частности полипропилен, с помощью нагревательного сопла и нанесите ее слой за слоем.
После печати смешайте 1 000 микролитров коллагена I типа с раствором генипина и гидроксида натрия, держа смесь на льду. Осторожно добавьте агар и раствор коллагена в соответствующие матричные отсеки напечатанной на 3D-принтере камеры. Поместите камеру в инкубатор с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на 60-90 минут, чтобы матрица полимеризовалась.
Затем добавьте 150 микролитров питательной среды поверх матрицы и инкубируйте ее в течение ночи. Для встраивания клеток caki-1 добавьте 25 микролитров клеточной суспензии, а затем 75 микролитров коллагена типа I в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку. Тщательно перебейте смесь в вортс.
Теперь осторожно добавьте в тюбик 100 микролитров расплавленного 2%-ного агарозного геля и продолжайте вортексирование, пока гель не станет однородным. Поместите камеру в инкубатор и поддерживайте условия на уровне 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Через час добавьте 150 микролитров клеточной среды поверх матрицы, чтобы предотвратить высыхание.
На следующий день с помощью шпателя удалите матрицу из камеры. Поместите 3D-матрицу с клетками в 24-луночный планшет, содержащий 1000 микролитров питательной среды, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов. Для введения клеток RPTEC/TERT1 загрузите 10 микролитров клеточной суспензии в микропипетку с наконечником объемом 10 микролитров.
Осторожно введите клеточную суспензию в заранее подготовленный затвердевший коллагеновый матрикс через клеточный отсек внутри камеры. Поместите камеру в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Через 60 минут добавьте 150 микролитров клеточной среды поверх матрицы, чтобы предотвратить высыхание, и инкубируйте клетки в течение 24 часов.
Затем извлеките матрицу из камеры с помощью шпателя и поместите ее в 24-луночный планшет, содержащий 1000 микролитров питательной среды, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Теперь добавьте гели к чипу. Соедините чип с матрицей 3D-ячейки с системой перфузии с помощью трубки.
Задайте параметры системы и поместите чип в инкубатор. После завершения перфузии извлеките гели из системы перфузии и промойте их PBS. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило типичную морфологию почечных канальцев как непрерывных с плотным монослоем, расположенным в центре геля.
Сфероид почечно-клеточной карциномы оказался округлым и однородного размера. Жизнеспособность клеток оставалась стабильной в течение периода культивирования без лечения, о чем свидетельствует стабильная утечка ЛДГ между первым и пятым днями. Повышенная активность каспаз в присутствии иммунных клеток свидетельствовала об усилении апоптоза.
Под влиянием сфероидной почечно-клеточной карциномы почечные канальцы проявляли обогащенную экспрессию генов, связанных с регуляцией иммунной системы. Секреция ФНО-альфа была повышена в почечных канальцах в кокультуре со сфероидами почечно-клеточной карциномы.
