La nostra ricerca utilizza un modello di cancro del rene su chip per studiare le interazioni tra cellule renali sane e tumorali. Questo sistema ci aiuta a replicare una condizione in viva che ci consente di studiare i cambiamenti indotti dal tumore nell'espressione genica, nell'infiammazione e nel metabolismo. Fornisce inoltre informazioni molto chiare sulla progressione del cancro del rene e sui suoi effetti sui tessuti sani circostanti.
Il sistema avanzato per il cancro del rene su chip utilizza molti approcci come la microfluidica, la biostampa 3D, l'imaging ad alta risoluzione, i biosensori in tempo reale, il sequenziamento dell'RNA e lo screening CRISPR. Queste tecnologie ci consentono di creare una simulazione davvero precisa delle condizioni renali in viva che ci consente di studiare le risposte cellulari e i cambiamenti dell'espressione genica. Raggiungere la riproducibilità negli esperimenti microfluidici è molto impegnativo.
Problemi tecnici come la manipolazione precisa dei liquidi possono portare a una variabilità dei risultati. Inoltre, le complesse fluttuazioni dei protocolli nelle portate e nelle condizioni ambientali influenzano ulteriormente i risultati coerenti. La nostra prossima ricerca si concentrerà sull'identificazione delle firme dei micro RNA associate alla progressione del cancro del rene e sulla valutazione del loro potenziale come biomarcatori della malattia.
Per iniziare, progetta la camera richiesta composta da quattro scomparti paralleli utilizzando un software di progettazione assistita da computer. La camera deve contenere due compartimenti cellulari, un compartimento matrice e un canale di collegamento. Per la stampa 3D della camera, fondere un filamento di bioplastica, in particolare il polipropilene, utilizzando un ugello di riscaldamento e depositarlo strato per strato.
Dopo la stampa, mescolare 1.000 microlitri di collagene di tipo I con la soluzione di genipina e idrossido di sodio mantenendo la miscela in ghiaccio. Aggiungere con cautela l'agar e la soluzione di collagene nei rispettivi compartimenti della matrice della camera stampata in 3D. Posizionare la camera in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 60-90 minuti per consentire alla matrice di polimerizzare.
Quindi aggiungere 150 microlitri di terreno di coltura sopra la matrice e incubarla per una notte. Per l'inclusione cellulare caki-1, aggiungere 25 microlitri di sospensione cellulare, seguiti da 75 microlitri di collagene di tipo I in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Agitare accuratamente la miscela.
Ora, aggiungi con cura 100 microlitri di gel di agarosio fuso al 2% nel tubo e continua a vorticare fino a quando il gel diventa omogeneo. Posizionare la camera nell'incubatrice e mantenere le condizioni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo un'ora, aggiungere 150 microlitri di terreno cellulare sopra la matrice per evitare che si secchi.
Il giorno seguente, utilizzare una spatola per rimuovere la matrice dalla camera. Posizionare la matrice 3D con le cellule in una piastra a 24 pozzetti contenente 1.000 microlitri di terreno di coltura e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per l'iniezione di cellule RPTEC/TERT1, caricare 10 microlitri della sospensione cellulare in una micropipetta con puntale da 10 microlitri.
Iniettare con cautela la sospensione cellulare nella matrice di collagene solidificato precedentemente preparata attraverso il compartimento cellulare all'interno della camera. Posizionare la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Dopo 60 minuti, aggiungere 150 microlitri di terreno cellulare sulla parte superiore della matrice per evitare che si secchi e incubare le cellule per 24 ore.
Quindi, rimuovere la matrice dalla camera utilizzando una spatola e posizionarla in una piastra a 24 pozzetti contenente 1.000 microlitri di terreno di coltura e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Ora aggiungi i gel al chip. Collegare il chip con la matrice cellulare 3D al sistema di perfusione utilizzando un tubo.
Imposta i parametri di sistema e inserisci il chip nell'incubatrice. Al termine della perfusione, rimuovere i gel dal sistema di perfusione e risciacquarli con PBS. La colorazione in immunofluorescenza ha confermato la morfologia tipica dei tubuli renali come continua con un monostrato stretto situato centralmente nel gel.
Lo sferoide del carcinoma a cellule renali appariva arrotondato e di dimensioni omogenee. La vitalità cellulare è rimasta costante durante il periodo di coltura senza trattamenti, come dimostrato dalla perdita stabile di LDH tra il primo e il quinto giorno. L'aumento dell'attività delle caspasi in presenza di cellule immunitarie indicava un aumento dell'apoptosi.
Sotto l'influenza dello sferoide del carcinoma a cellule renali, i tubuli renali hanno mostrato un'espressione arricchita di geni associati alla regolazione del sistema immunitario. La secrezione di TNF-alfa è risultata elevata nei tubuli renali in co-coltura con gli sferoidi del carcinoma a cellule renali.
