Unsere Forschung verwendet ein Nierenkrebs-on-Chip-Modell, um die Wechselwirkungen zwischen gesunden und krebskranken Nierenzellen zu untersuchen. Dieses System hilft uns, eine In-Viva-Erkrankung zu replizieren, die es uns ermöglicht, tumorbedingte Veränderungen der Genexpression, der Entzündung und des Stoffwechsels zu untersuchen. Es bietet auch sehr klare Einblicke in das Fortschreiten von Nierenkrebs und auch seine Auswirkungen auf das umliegende gesunde Gewebe.
Das fortschrittliche On-Chip-System für Nierenkrebs nutzt viele Ansätze wie Mikrofluidik, 3D-Bioprinting, hochauflösende Bildgebung, Echtzeit-Biosensoren, RNA-Sequenzierung und CRISPR-Screening. Diese Technologien ermöglichen es uns, eine wirklich präzise Simulation von Nierenerkrankungen in Viva zu erstellen, die es uns ermöglicht, die zellulären Reaktionen und Veränderungen der Genexpression zu untersuchen. Das Erreichen der Reproduzierbarkeit in mikrofluidischen Experimenten ist eine große Herausforderung.
Technische Probleme wie präzises Liquid Handling können zu einer Variabilität der Ergebnisse führen. Darüber hinaus beeinflussen die komplexen Protokolle, Schwankungen der Durchflussraten und Umgebungsbedingungen die konsistenten Ergebnisse zusätzlich. Unsere bevorstehende Forschung wird sich auf die Identifizierung von microRNA-Signaturen konzentrieren, die mit dem Fortschreiten von Nierenkrebs assoziiert sind, und auf die Bewertung ihres Potenzials als Biomarker für die Krankheit.
Entwerfen Sie zunächst die gewünschte Kammer mit vier parallelen Kammern mit Hilfe einer computergestützten Konstruktionssoftware. Die Kammer muss zwei Zellkompartimente, ein Matrixkompartiment und einen Verbindungskanal enthalten. Für den 3D-Druck der Kammer schmelzen Sie ein Biokunststoff-Filament, insbesondere Polypropylen, mit einer Heizdüse und tragen es Schicht für Schicht auf.
Mischen Sie nach dem Druck 1.000 Mikroliter Kollagen Typ I mit dem Genipin und der Natronlauge, während Sie die Mischung auf Eis halten. Gib den Agar und die Kollagenlösung vorsichtig in die jeweiligen Matrixfächer der 3D-gedruckten Kammer. Stellen Sie die Kammer für 60-90 Minuten in einen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit die Matrix polymerisieren kann.
Geben Sie dann 150 Mikroliter Nährmedium auf die Matrix und inkubieren Sie es über Nacht. Für die Einbettung von CAKI-1-Zellen geben Sie 25 Mikroliter Zellsuspension, gefolgt von 75 Mikrolitern Kollagen Typ I in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Mischung gründlich einreiben.
Geben Sie nun vorsichtig 100 Mikroliter geschmolzenes 2%iges Agarosegel in die Tube und wirbeln Sie weiter, bis das Gel homogen wird. Stellen Sie die Kammer in den Inkubator und halten Sie die Bedingungen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid aufrecht. Geben Sie nach einer Stunde 150 Mikroliter Zellmedien auf die Matrix, um ein Austrocknen zu verhindern.
Am nächsten Tag verwenden Sie einen Spatel, um die Matrize aus der Kammer zu entfernen. Legen Sie die 3D-Matrix mit den Zellen in eine 24-Well-Platte mit 1.000 Mikrolitern Kulturmedium und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Für die Injektion von RPTEC/TERT1-Zellen laden Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in eine Mikropipette mit einer 10-Mikroliter-Spitze.
Injizieren Sie die Zellsuspension vorsichtig durch das Zellkompartiment innerhalb der Kammer in die zuvor vorbereitete erstarrte Kollagenmatrix. Stellen Sie die Kammer in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie nach 60 Minuten 150 Mikroliter Zellmedium auf die Matrix, um ein Austrocknen zu verhindern, und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.
Nehmen Sie anschließend die Matrix mit einem Spatel aus der Kammer und legen Sie sie in eine 24-Well-Platte mit 1.000 Mikrolitern Nährmedium und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Gib nun die Gele auf den Chip. Verbinden Sie den Chip mit der 3D-Zellmatrix über einen Schlauch mit dem Perfusionssystem.
Stellen Sie die Systemparameter ein und legen Sie den Chip in den Inkubator. Entfernen Sie nach Abschluss der Perfusion die Gele aus dem Perfusionssystem und spülen Sie sie mit PBS aus. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die typische Morphologie der Nierentubuli als kontinuierlich mit einer engen Monoschicht, die sich zentral im Gel befindet.
Das Nierenzellkarzinom sphäroid erschien rundlich und homogen groß. Die Zellviabilität blieb über den Kulturzeitraum ohne Behandlungen konstant, wie eine stabile LDH-Leckage zwischen den Tagen eins und fünf zeigte. Eine erhöhte Caspase-Aktivität in Gegenwart von Immunzellen deutete auf eine verstärkte Apoptose hin.
Unter dem Einfluss des Nierenzellkarzinom-Sphäroids zeigten die Nierentubuli eine angereicherte Expression von Genen, die mit der Regulation des Immunsystems assoziiert sind. Die TNF-alpha-Sekretion war in den Nierentubuli in der Co-Kultur mit den Nierenzellkarzinom-Sphäroiden erhöht.
