私たちの研究では、腎臓がんチップモデルを使用して、健康な腎臓細胞とがんの腎臓細胞との間の相互作用を調査しています。このシステムは、遺伝子発現、炎症、および代謝における腫瘍による変化を研究することを可能にする生体内状態を再現するのに役立ちます。また、腎臓がんの進行と、それが周囲の健康な組織に及ぼす影響についても非常に明確な洞察を提供します。
高度な腎がんオンチップシステムは、マイクロ流体工学、3Dバイオプリンティング、高解像度イメージング、リアルタイムバイオセンサー、RNAシーケンシング、CRISPRスクリーニングなどの多くのアプローチを利用しています。これらの技術により、生体内腎臓の状態を非常に正確にシミュレーションすることができ、細胞の応答や遺伝子発現の変化を研究することができます。マイクロ流体実験での再現性を達成するのは、非常に困難です。
正確なリキッドハンドリングなどの技術的な問題は、結果のばらつきにつながる可能性があります。さらに、流量や環境条件の複雑なプロトコルの変動は、一貫した結果にさらに影響を及ぼします。私たちの今後の研究は、腎臓がんの進行に関連するマイクロRNAシグネチャーを特定し、疾患バイオマーカーとしての可能性を評価することに焦点を当てます。
まず、コンピューター支援設計ソフトウェアを使用して、4つの平行なコンパートメントで構成される必要なチャンバーを設計します。チャンバーには、2つのセルコンパートメント、1つのマトリックスコンパートメント、および接続管が含まれている必要があります。チャンバーを3Dプリントするには、加熱ノズルを使用してバイオプラスチックフィラメント、特にポリプロピレンを溶かし、層ごとに堆積させます。
印刷後、1, 000マイクロリットルのI型コラーゲンをゲニピンと水酸化ナトリウム溶液と混合し、混合物を氷上に保持します。寒天とコラーゲン溶液を3Dプリントチャンバーのそれぞれのマトリックスコンパートメントに慎重に加えます。チャンバーを摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに60〜90分間置き、マトリックスを重合させます。
次に、マトリックスの上に150マイクロリットルの培地を加え、一晩インキュベートします。caki-1細胞の埋め込みには、25マイクロリットルの細胞懸濁液を追加し、続いて75マイクロリットルのI型コラーゲンを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。混合物を徹底的にボルテックスします。
次に、100マイクロリットルの溶融した2%アガロースゲルをチューブに慎重に加え、ゲルが均一になるまでボルテックスを続けます。チャンバーをインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素で摂氏37度の条件を維持します。1時間後、乾燥を防ぐためにマトリックスの上に150マイクロリットルの細胞培地を加えます。
翌日、へらを使用してマトリックスをチャンバーから取り出します。細胞を含む3Dマトリックスを1, 000マイクロリットルの培養培地を含む24ウェルプレートに入れ、5%二酸化炭素と摂氏37度で24時間インキュベートします。RPTEC/TERT1細胞を注入するには、10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルの先端を持つマイクロピペットにロードします。
チャンバー内の細胞コンパートメントを通じて、事前に調製した固化コラーゲンマトリックスに細胞懸濁液を慎重に注入します。チャンバーを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。60分後、マトリックスの上に150マイクロリットルの細胞培地を加えて乾燥を防ぎ、細胞を24時間インキュベートします。
次に、へらを使用してチャンバーからマトリックスを取り出し、それを1, 000マイクロリットルの培地を含む24ウェルプレートに入れ、5%の二酸化炭素と摂氏37度でインキュベートします。次に、チップにゲルを追加します。3D細胞マトリックスを装着したチップをチューブを使用して灌流システムに接続します。
システムパラメータを設定し、チップをインキュベーターに入れます。灌流が完了したら、ゲルを灌流システムから取り出し、PBSですすいでください。免疫蛍光染色により、腎尿細管の典型的な形態が連続的であり、ゲルの中央にタイトな単層が配置されていることが確認されました。
腎細胞がんスフェロイドは丸みを帯び、均質なサイズに見えました。細胞生存率は、1日目から5日目までの安定したLDH漏出が示すように、無処理の培養期間にわたって一貫していました。免疫細胞の存在下でのカスパーゼ活性の増加は、アポトーシスの増強を示しました。
腎細胞癌スフェロイドの影響下で、腎尿細管は免疫系の調節に関連する遺伝子の濃縮発現を示しました。TNF-α分泌は、腎細胞癌スフェロイドとの共培養において腎尿細管で上昇しました。
