Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Özet

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize tarif In vitro Tahlil T1D geliştirmek için risk altındaki kişilerde bağışıklık dengesizlik tespit yeteneğine sahip.

Özet

Düzenleyici T hücreleri (Tregs), self-antijenleri immün tolerans kritik arabulucular. Buna ek olarak, önemli bir enfeksiyon sonrası immün yanıt düzenleyicileri. Tregs benzersiz yüzey işaretleyici tanımlamak için çabalarına rağmen, sadece benzersiz özellik efektör T hücrelerinin çoğalması ve işlevi bastırmak için yeteneğidir. In vitro tayinlerde, sadece insan Treg fonksiyon değerlendirilmesinde kullanılabileceğini açık olmakla birlikte, otoimmün hastalıkları (Tip 1 Diyabet-T1D gibi) ihtiyacı olan kişilerde sağlıklı hücre ve hücreler izole kesitsel çalışmalardan elde edilen sonuçlar değerlendirilirken, bu sorunlu olur karşılaştırılabilir. Cevapçı oranları ve insan, antijen sunan hücrelerin sayısı ve türü (APC), in vitro bastırma tayinlerde: Cevapçı T hücreleri, stimülasyon doğası ve gücü, Treg sayısı ve türü laboratuvarlar arasında büyük bir değişkenlik yoktur. Bu değişkenliği Treg fonksiyonu zor ölçüm çalışmalar arasında karşılaştırma yapar. Treg alan sağlıklı kişilerde ve otoimmün hastalıklar ile çalışacak bir standart bastırma tahlil gerekiyor. Biz, pankreas β-hücrelerinin otoimmün yıkımı temel konularla karşılaştırıldığında sağlıklı gönüllüler izole edilen T hücrelerinin uyarılması çok az test içi değişkenlik gösterir in vitro bastırma tayininde geliştirdik . Bu parça ana hedefi, farklı konu grupları arasında karşılaştırma sağlayan in vitro insan bastırma tayininde bir tanımlamak için. Ayrıca, bu testte, küçük bir fonksiyon nTreg kaybı tasvir ve gelecekte daha da kaybı, önleyici ^{immünomodülatör} tedavi 1 yararlanabilir böylece tespit konularda tahmin etmek potansiyele sahiptir. Aşağıda, bu yordamı yer alan adımları ayrıntılı bir açıklama sağlar. Treg fonksiyonu ölçmek için kullanılan in vitro bastırma tayininde standardizasyon katkıda bulunmayı umuyoruz. Buna ek olarak, bağışıklık dengesizliği erken bir devlet ve T1D için potansiyel bir fonksiyonel biyomarker tanımak için bir araç olarak bu testte sunuyoruz.

Protokol

1. Bir bastırma tahlil kurmadan önce, daha sonra hücre uyarılması ve bir ihtiyacı için anti-insan CD3 (klon UCHT1, nihai konsantrasyonu 1μg/ml) kat tosylactivated boncuk boncuk verimli insan kullanarak in vitro proliferasyonu tayininde kurma kaplı olup olmadığını kontrol edin T hücreleri

1. Orijinal şişe, manyetik standı yer M-450 tosylactivated boncuk 1ml alın ve tüm boncuklar tüp tarafına yapıştırılır kadar tutun. Tüp manyetik stand hala tamponu çıkarın. 37, ajitasyon tekrar süspansiyon boncuk buffer1 1 ml ve anti-insan CD3 40μl eklemek °; manyetik stand tüp ve buffer1 1 ml ekleyin, tekrar tüp manyetik standında yer ve tüp manyetik standında ise buffer1 kaldırmak C'de 15 dakika boyunca,% 0.1 w / v BSA ekleyin ve önümüzdeki 16 saat boyunca ajitasyon devam ediyor.
2. 5 dakika boyunca tampon kaldırmak ve buffer2 1 ml boncuklar tekrar süspansiyon; boncuk ° C ve bir kez, 5 dakika buffer3 içinde 2-8 ° C yukarıda açıklandığı gibi manyetik standı kullanarak 2-8, iki kez buffer2 boncuk yıkayın 4x10 ⁸ / ml son konsantrasyon ve kullanıma hazır.
3. Kısım 50.000 ve 25.000 PBMC / 96 plaka triplicates ve CD3 kaplı boncuklar değişken sayısı (4x10 ⁸ boncuk / ml, CD3 1μg/ml, örneğin 1, 2, 3, 4, 5 boncuk / hücre eklemek ) hücre başına boncuk optimal sayısını belirlemek için. 72 saat sonra kültür, 1μCi ^[3 H] timidin ekleyin ve 37 kuluçka ° C önümüzdeki 16 saat boyunca devam ediyor. Çoklu hasat plaka (Millipore) Hasat hücreleri, parıldamanın sıvı ve Kont NXT (Packard, CT) kullanılarak / dakika başına sayıları (CPM) okuyun. BGBM'leri 5000 yukarıda boncuk / hücre oranı ancak daha az 15000 baskılayıcı fonksiyonunu kaybedebilir Tregs, aşırı uyarılma önlemek için kullanın. Genellikle 3 boncuk / hücre oranı, şu ana ^kadar 1-4 test edilen tüm konu gruplarında cevaplayıcı ve Treg hücreleri uyarır .

2. Sağlıklı donörlerin veya insan leukopacks veya genellikle yerel Kan Transfüzyon Merkezleri sorumlu sağlıklı gönüllü ve alınan buffy coat (BC) (Şekil 1) tam kan hücre izolasyonu

1. M.Ö. (~ 50 ml) 01:06 PBS ile (add 250ml) seyreltilir. Şimdi 300ml toplam hacmi vardır. Yavaşça seyreltilmiş M.Ö. 25ml 15ml Ficoll-Paque üst katmanı PLUS katmanları bozmadan, 50ml Falcon tüpler ekledi. 30 dakika 4 ° C, frenler için 800xg Santrifüj (sallanan kova rotor SH-3000 ile Sorvall santrifüj 1400) kapalı.
2. Hücre katmanı (ara faz) dikkatli bir şekilde toplamak ve yeni bir 50ml Falcon tüpler aktarmak. PBMC DPBS ile 50ml tüpleri doldurarak yıkayın. Bir tüp içine 2 hücre pelletleri toplayın. 4 10 dakika 400xg santrifüjleyin ° C Her seferinde tek bir tüp içine 2 hücre pelletleri birleştirerek, iki kez adım yıkama tekrarlayın. Tek bir tüpe 50ml tüm hücre pelletleri birleştirin.
3. Tripan Mavi dışlama testi kullanılarak hücre güvenin. 180μl Tripan Mavi leke PBMC, 20μl ekleyerek Tripan Blue 1:10 seyreltme olun. İyice karıştırın ve hemen hemasitometre saymak 20μl almak. Iki kare blok, her biri 16 küçük kare içeren bulunan tüm lekesiz ve sadece mavi boyanan hücrelerin sayıları sayma. Iki numara ortalama 10 ile çarpın. Hücre / ml 'lik bir numara almak için bu sayı 100 ile bölün. Canlı hücreler Yüzde olarak hesaplamak [1 - (mavi hücre sayısı / toplam hücre sayısı) x100]. Yaşayabilirliği ≥% 95 ise devam edin.

3. CD4-T hücreleri MACS ön sıralamak

1. Devam etmeden önce, yeni bir tüp içine PBMC 1 ml transfer 5000rad bu ışınlanması için hücreleri hazırlamak için medya 4ml eklemek antijen-sunan hücreler (APC) olacaktır.
2. PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 250xg hücreleri geri kalanı Santrifüj 10 dakika süreyle 4 ° C PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 4ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri dökün.
3. MACS anti-CD4 mikro 200μl ekleyin ve 4 ° C'de 20 dakika için.
4. 250xg PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon ve santrifüj 40ml ekleyerek yıkayınız 10 dakika süreyle 4 ° C Gazlar, oda sıcaklığında PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon, 8 ml supernatant ve tekrar süspansiyon dökün.
5. LS sütun üzerinde yüklemeden önce Ön ayırma filtreleri kullanarak Filtre ayrı hücre süspansiyonu.
6. Split hücre süspansiyonu ve katman 4ml üzeri kalibre her LS kolon (deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 3ml). LS sütun MidiMACS ayırıcı sabittir. Hücre süspansiyonu, yeniden çalıştırmak flowthrough ya biterse veya PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon deggassed oda sıcaklığında 3ml eklemek ve tampon aracılığıyla çalışmasına izin önce. Daha fazla tampon temizlemek gelene kadar ekleyin.
7. LS sütun üzerine Pipet 5ml deggassed tampon aracılığıyla ~ 1.0ml çalıştırmanızı sağlayarak yeni bir steril 15ml toplama tüpünün içine LS Sütun MidiMACS ayırıcı ve yerden kaldırmak. Sütuna piston koyun ve yavaş yavaş geri kalanı itinhacminin.
8. Her iki LS sütunları ile aynı yapın ve iki CD4 + kesirler birleştirmek. 50ml PBS ve sayısı hücrelere ekleyin. Beklenen verim 5x10 ⁸ hücrelere kadar. 2ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA tampon 10 dakika ve tekrar süspansiyon hücreleri 400xg santrifüjleyin.

4. Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) izolasyonu (Şekil 2)

1. Aşağıdaki hücre yüzey belirteçleri (ışıktan korumak) CD işaretçileri antikorların bir kokteyl olun: 20 ul anti-insan CD8-FITC (klon RPA-T8), anti-insan CD14-FITC (klon M5E2 20 ul; LPS reseptör), 20 anti-insan CD32-FITC (klon FLI8.26 ul; FcγR tip II) ve anti-insan CD116-FITC (klon M5D12 6 ul GM CSFRα zinciri) ve alternatif olarak, 40μl karşıtı ekleyin insan CD4-APCCy7 (klon RPA-T4).
2. 2ml hücre süspansiyonu 5μl alın ve leke kokteyl 2μl ile leke, bu eşik (Florokrom Eksi Bir ​​FMO) ⁵ belirlemek için bir tüp.
3. Leke kokteyl ve 4 ° C 30 dakika hücre süspansiyonu ve inkübe kokteyl, anti-insan CD25-PE (IL-2Rα klon M-A251) 50 ul ekleyin. 10 dakika 10 ⁷ / ml bir hücre konsantrasyonu ve tekrar süspansiyon hücreleri için 400xg PBS, santrifüj hücre yıkayın.
4. Boyanmamış hücre ve hücreler veya hücre FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ) sıralama için tazminat kontrolü olarak kullanmak için tek florokrom ile boyandı boncuk hazırlayın.
5. FMO tüp hücreleri Edinme kullanıcı CD25 + T hücreleri (Şekil 2a) sıralama için eşik ayarlamak için izin verecektir. FITC-pozitif hücreler, monositler, makrofajlar ve diğer tüm CD4 + T hücreleri (Şekil 2b) oluşan dışlamak için bir kapı FITC-negatif hücrelerin etrafındaki ayarlayın.
6. Ayrı bir arsa, CD25, CD25low ve CD25high T hücreleri-Tregs (üst, en yüksek sayıda CD25 eksprese eden hücrelerin% 1) (Şekil 2c) için geçitler çizerek. Hücre alt grupları genellikle yüksek saflıkta (Şekil 2d, 2e ve 2f) göstermektedir.
7. 10 dakika için 400xg hücre toplama tüpleri Santrifüj ve kaplama kadar buz üzerinde saklayın.

5. 200μl/well 96-plaka (düzeni Tablo 1 olarak eklenmiştir) hücre kültürü ayarlayın

1. CD3 kaplı boncuklar kısım 50μl (1 mcg / ml) 3 boncuk / U-alt% 10 toplanmış insan AB serum ile eksiksiz bir medya yeniden süspanse iyi cevaplayıcı hücre, 96-kuyucuğu olarak hesaplanmıştır. (Örneğin, CD3 kaplı 2ml medya, CD3 kaplı stok boncuk final konsantrasyonu 4x10 ⁸ / ml 7.5μl almak ve medya 2ml sulandırmak; her 50μl 75.000 beads-3beads/cell içerecektir).
2. 5x10 ⁵ / ml hücre konsantrasyonunu ışınlanmış APC seyreltilir ve "sadece Tregs" olarak etiketlenen kuyular, Tablo "sadece APC" ve "medya sadece" dahil olmak üzere, önceden eklenmiş stimülasyon, her kuyuya 50μl eklemek ^(2.5 x 10 4 hücreler içeren) 1.
3. Tablo 1'de tasarım aşağıdaki triplicates 2.5 x 10 ⁴ / iyi CD4CD25 veya CD4CD25low T hücreleri ekleyin.
4. Oranı 1:10 (2,500 Treg hücreleri) co-kültürler (satır B, Tablo 1) ve "sadece Tregs" olarak etiketlenen kuyulara Tregs ekle ve% 5 CO ₂ ile CO ₂ inkübatör plaka 37 ° C'de inkübe , 72 saat boyunca nem doymuş.
5. Darbe 1μCi ^[3 H] timidin ile kuyu ve inkübasyon 37 ° C Sonraki 16 saat boyunca devam ediyor.

6. Hasat ve sayım

1. Packard filtermate döver ya da alternatif bir sistem kullanarak çoklu hasat plaka üzerinde Hasat hücreleri.
2. Sintilasyon sıvı (Microscint 20), son adım için hazırlık, şeffaf plastik bir kapak ile plaka hasat kapsar.
3. Dakika başına sayıları (CPM) Okuma / Kont NXT (Packard, BT) veya alternatif bir sistem kullanıyor.

7. Bastırma Bilgisayar yüzdesi

1. Hücreleri triplicates kültüre edildi olarak, ortalama her durum için hesaplanır. Varyasyon katsayısı>% 30 ise, uç ortalama iki kuyu yok ve sadece kopyaya. Bastırma Yüzde hesaplama ile elde edilir [(sc) / s] x% 100 = kopyaya tek kültür ve c = ko-kültür cpm.
2. Naif (CD25-) ve in vivo aktif (CD25low) efektör T hücreleri cevaplayıcı T hücreleri olarak kaplama, bu alt gruplarının her bastırmak için Tregs yeteneğini fark öncül dayalı bir potansiyel fonksiyonel prognostik göstergesi olarak yakalanan ve kullanılan olduğu gibi bu aktif hücrelerin bastırmak için zordur.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Büyük değişkenlik yöntemleri kullanılmış ve in vitro insan bastırma tahlil edilen sonuçlar bize tahlil ¹ etkileyen koşulların kapsamlı bir çalışma gerçekleştirmek için istenir. Daha önce ⁶ belirlenir Teffs (1:10): Biz Tregs arasında düşük oranı göz önünde bulundurularak, Treg fonksiyonu sadece test tahlil, aynı zamanda saflık geliştirdik. Buna ek olarak, Tregs th farklıbağışıklık dengesini tehlikeye T1D geliştirmek için risk altındaki kişilerde olduğu gibi başarıyla, naif ve Şekil 3 ve daha belirgin hale gelir, ^{önceki çalışmalarda} 2,4, gösterildiği gibi sağlıklı kişilerde bile vivo aktive T hücreleri, bastırmak için EIR yeteneği . Tahlil bize sağlıklı kontrol arasındaki fonksiyon karşılaştırmak için izin verir, biz doğal (nTregs), indüklenebilir (iTregs) ve in vitro genişletilmiş nTregs baskılayıcı fonksiyon karşılaştırıldığında çalışmada çok iyi çalıştı, yeni başlangıçlı (RO) T1D ve uzun süreli ( LS ) T1D konular. Biz RO T1D konularda fonksiyonel iTregs ve genişletilmiş nTregs üretme LS T1D ve sağlıklı bireyde ⁷ ile karşılaştırıldığında daha iyi bir kapasiteye sahip olduğu sonucuna varmıştır. Böylece, bu testte bağışıklık dengesizliği erken ve geç devlet hem de tanıma mükemmel bir araç olarak kullanılabilir.

Programı 1 şematik sunumu in vitro bastırma tayininde yer alan adımları

Şekil 1 fotoğraflarla birlikte sunulan in vitro bastırma tayininde Adımları

Şekil 2 FACS hücre izolasyonu Ayırıcı stratejisi. FITC-negatif hücrelerin (daha kapı vardı ve CD + CD25, CD + CD25low ve CD + CD25high olarak toplanan bir) CD25 + eşik) hücreler, c FITC-negatif olarak kapılı idi) Florokrom Eksi Bir (FMO), b göre ayarlanabilir oldu Tregs) yüzdeleri, d ile gösterilir) e sıralama sonra CD + CD25low sıralaması, sıralama sonra Tregs sıralaması FACS) FACS, ve f) sıralama sonra sıralaması CD4 + CD25-T hücrelerinin FACS

Şekil 3 sağlıklı bireylerden Temsilcisi sonuçları a) ilgili tüm hücre alt grupları için tek kültür olarak sunulan sağlıklı birey (naif-CD25-, in vivo aktif-CD25low, antijen sunan hücreler APC dakikada sayar Temsilcisi (CPM) ve Her CD25 ve otolog Tregs CD25low cevaplayıcı T hücrelerinin sağlıklı kontrol olgusu sunulmuştur (n bastırma düzenleyici T hücreleri-Treg) yanı sıra cevaplayıcı T hücrelerinin ortak kültürler (CD25-veya CD25low) ve Tregs b) Yüzde = 4). Bastırılması [(sc) / s] olarak hesaplanmıştır x% 100 = kopyaya kadar tek bir kültür ve c = kopyaya ko-kültür. Cevapçı T hücrelerini bastırmak için Tregs kapasitesi hafif fark fark olmasına rağmen,. C (t-testi p = 0.08 eşleştirilmiş)) Sunan cevaplayıcı olarak CD25 ve CD25low de dahil olmak üzere, tek tek her kültür için risk konular kopyaya kadar önemli değildi T hücrelerinin yanı sıra her cevaplayıcı T hücre alt otolog her CD25 ve CD25low cevaplayıcı T hücrelerinin baskılanması Tregs (CD25-/Tregs ve CD25low/Tregs) d) Yüzde numaralı seribaşı APC ve Tregs ve ortak kültürler Tregs riskli grup (n = 4) sunulmuştur. CD25-versus CD25low cevaplayıcı T hücreleri bastırmak için Tregs kapasitesi arasındaki fark anlamlıydı (eşleştirilmiş t-testi p = 0.04).

Tablo 1. Şematik in vitro bastırma tayininde kurdu

	1-3	4-6	7-9	10-12
A	CD4CD25-	CD4CD25low	sadece medya	sadece medya
B	CD4CD25-/ Tregs	CD4CD25low / Tregs	Sadece Tregs	APC sadece
C
D
E
F
G
H

Tartışmalar

Tregs tek benzersiz özellik olarak, baskılayıcı fonksiyonu aynı içinde ve farklı çalışmalar arasında hastalık gelişiminin farklı aşamalarını güvenilir ve düzgün konular arasında test edilmelidir. Biz bu testinin standardizasyonu için katkı olarak laboratuvarda geliştirilen bastırma tahlil detayları sunar. Geniş optimizasyon çalışması, insan anti-CD3 kaplı boncuklar (APC olarak hücre ile birlikte 1μg/ml konsantrasyonu UCHT1 klon (piyasada mevcut 5μg/ml karşı) ile T hücre stimülasyon...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif ya da enstrüman Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Ficoll-Paque PLUS	Amersham Pharmacia Biotech	17-1440-03
DPBS-1X	Gibco	14190-144
Tripan Mavi	Invitrogen	15250-061
anti-CD4 mikro	Miltenyi	130-045-101
Ön ayırma filtreleri	Miltenyi	130-041-407
LS sütun	Miltenyi	130-042-401
EDTA	Invitrogen	15575-020
BSA	Sigma-Aldrich	B4287
Anti-insan CD4-APCCy7 (klon RPA-T4)	BD Pharmingen	557852
Anti-insan CD25-PE (klon M-A251; IL-2Rα)	BD Pharmingen	555432
Anti-insan CD8-FITC (klon RPA-T8)	BD Pharmingen	555366
Anti-insan CD14-FITC (klon M5E2; LPS reseptör)	BD Pharmingen	555397
Anti-insan CD32-FITC (klon FLI8.26 FcγR tip II)	BD Pharmingen	555448
Anti-insan CD116-FITC (klon M5D12; GM-CSFRα zinciri)	BD Pharmingen	554532
Dynalbeads M-450 tosylactivated	Invitrogen	140-13
Anti-insan CD3	Ancell	144-024
Buffer1	Ev yapımı		0.1M Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2	Ev yapımı		PBS/2mM EDTA /% 0.1 BSA pH7.4
Buffer3	Ev yapımı		% 0,2 M Tris/0.1 BSA pH8.5
Alexa RPMI medya	Ev yapımı		RPMI 1640 medya 2 mM L-glutamin 5 mM HEPES 100 U / mg / ml Peni / strept 0.5 mM sodyum piruvat
[3 H] timidin	Perkin Elmer	NET027Z005MC
insan toplanmış AB serum	Atlanta Biyolojik	S40110
Çoklu hasat plaka	Millipore	MAHFC1H60
Microscint 20	Perkin Elmer	6013621