Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Резюме

Tregs являются мощными супрессоры иммунной системы. Существует недостаток уникальных маркеров поверхности, чтобы определить их, следовательно, определения Tregs в первую очередь функциональны. Здесь мы опишем оптимизированы В пробирке Анализ позволяет идентифицировать иммунный дисбаланс в предметы на риск развития СД1.

Аннотация

Регуляторных Т-клеток (Tregs) являются важнейшими медиаторами иммунной толерантности к самостоятельной антигенов. Кроме того, они играют решающую роль регуляторов иммунного ответа следующие инфекции. Несмотря на усилия по выявлению уникальных маркеров на поверхности Tregs, только уникальная особенность заключается в их способности подавлять пролиферацию и функцию эффекторных Т-клеток. Хотя очевидно, что только в лабораторных анализов могут быть использованы в оценке человеческой функции Treg, это становится проблематичным при оценке результатов из перекрестных исследований, в которых здоровые клетки и клетки, выделенные из пациентов с аутоиммунными заболеваниями (например, диабетом типа 1-СД1) нуждаются в для сравнения. Существует большая вариабельность лабораторий в количестве и типе ответчик Т-клеток, характера и силы раздражения, Treg: ответчик соотношения и количества и типа антиген-представляющих клеток (АПК), используемых в человека в пробирке тесты подавления. Эта изменчивость делает сравнение между исследованиями измерения Treg функции трудно. Treg поле должно стандартизированного анализа подавления, что будет хорошо работать с обоими здоровых людей и людей с аутоиммунными заболеваниями. Мы разработали в пробирке подавления анализ показывает, что очень мало внутри-анализ изменчивости стимуляции Т-клеток, выделенных из здоровых добровольцев по сравнению с людьми с сопутствующими аутоиммунными разрушение поджелудочной β-клеток. Основной целью этой части является описание в пробирке человеческих анализа подавления, что позволяет провести сравнение между различными группами тему. Кроме того, этот анализ имеет потенциал, чтобы очертить небольшой потерей в nTreg функции и предвидеть дальнейшую потерю в будущем, таким образом, определение субъектов, которые могут извлечь пользу из профилактическую терапию иммуномодулирующими ^1. Ниже мы приводим подробное описание этапов этой процедуры. Мы надеемся внести свой ​​вклад в стандартизацию в пробирке подавления анализа, используемые для измерения Treg функции. Кроме того, мы предлагаем этот анализ в качестве инструмента для признать ранней стадии иммунного дисбаланса и потенциал функциональных биомаркером СД1.

протокол

1. Перед настройкой подавления анализа, необходимо, чтобы покрыть tosylactivated бусин с анти-CD3 человека (клон UCHT1, окончательный 1μg/ml концентрация) для стимуляции клеток и потом проверить бисер эффективно покрытием путем создания в пробирке анализ распространения с использованием человеческих Т-клетки

1. Возьмите 1 мл М-450 tosylactivated бусы из оригинального флакона, помещают в магнитное стоять и держать, пока все бусины присоединившимся к стороне трубки. Удалить буфер, пока трубка находится все еще в магнитных стенда. Возьмите трубку из магнитных стоять и добавить 1 мл buffer1, место трубки в магнитное снова встать и снять buffer1 в то время как трубка в магнитном стенде; ресуспендирования бисером в 1 мл buffer1 и добавить 40μl анти-CD3 человека, агитировать при 37 ° С в течение 15 минут, добавьте 0,1% м / о BSA и продолжают агитировать за следующие 16 часов.
2. Вымойте бусины buffer2 два раза в течение 5 минут при температуре 2-8 ° С и один раз в buffer3 в течение 5 минут при температуре 2-8 ° С с использованием магнитных стоять, как описано выше, удалите буфер и ресуспендируйте бисером в 1 мл buffer2; бисер 4x10 ⁸ / мл конечной концентрации и готов к использованию.
3. Алиготе 50000 и 25000 РВМС / лунку в трем образцам в 96-луночного планшета и добавить переменное количество CD3 покрытием шариков (4x10 ⁸ бусин / мл, CD3 1μg/ml, например 1, 2, 3, 4, 5 бусин / элемент ), с тем чтобы определить оптимальное количество бусин на ячейку. После 72 часов в культуре, добавить 1μCi ^[3 H] тимидина и продолжают инкубацию при 37 ° С в течение следующих 16 часов. Урожай клеток в Multiscreen пластины урожая (Millipore), добавить жидкие сцинтилляционные и читать импульсов в минуту (CPM) / также использованием Top Граф NXT (Packard, штат Коннектикут). Использование бусин / элемент отношения, когда CPMS выше 5000, но менее 15000, чтобы избежать перевозбуждения из Tregs, которые могут потерять подавляющую функцию. Как правило, соотношение 3 бисер / клетка стимулирует как ответчик и Treg клетки во всех предметных группах испытания до сих пор ^1-4.

2. РВМС изоляции от цельной крови здоровых доноров или от человека leukopacks или лейкомассы (BC) обычно берут от здоровых добровольцев и предоставляется бесплатно от местных центров переливания крови (рис. 1)

1. Развести до н.э. (~ 50 мл) с 1:06 PBS (добавить 250 мл). Теперь есть 300 мл общего объема. Медленно слой 25 мл разбавленной до нашей эры на вершине 15 мл Ficoll-Paque PLUS добавлены 50 мл Сокол трубы, не нарушая слоев. Центрифуга на 800xg (1400rpm в центрифуге Sorvall с качающимися ведро ротор SH-3000) в течение 30 минут при температуре 4 ° С, с тормозами выключен.
2. Осторожно собрать слой РВМС (промежуточные фазы) и передать его на свежий 50мл Сокол труб. Вымойте РВМС, заполняя трубы до 50 мл с DPBS. Сбор 2 гранулы ячейки в одну трубу. Центрифуга на 400xg в течение 10 мин при 4 ° C. Повторите промывание войти дважды, каждый раз сочетание 2 гранулы клетки в одной трубе. Смешайте все ячейки шариков в одном 50 мл трубки.
3. Граф РВМС использованием Голубой Трипан исключения тест. Сделать 1:10 растворение в Голубой Трипан путем добавления 20 мкл РВМС на 180μl из Голубой Трипан пятно. Хорошо перемешать и принимать 20 мкл рассчитывать в hemacytometer немедленно. Граф номера всех неокрашенных и только синий окрашенных клеток, расположенных в два квадратных блоков каждый из которых содержит 16 малых квадратов. Возьмите среднего числа и умножить на 10. Разделите это число на 100, чтобы получить число РВМС / мл. Процент жизнеспособных клеток рассчитывать, что и [1 - (количество синих клеток / общее количество клеток) x100]. Приступить в случае жизнеспособность ≥ 95%.

3. MACS предварительной сортировки клеток CD4 Т-клеток

1. Прежде чем продолжить, передача 1 мл РВМС в новую пробирку, добавляют 4 мл среды для подготовки клетки при облучении 5000rad-они будут антиген-представляющих клеток (АПК).
2. Центрифуга остальные клетки на 250xg в PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA в течение 10 минут при 4 ° C. Слейте надосадочную и ресуспендирования клеток в 4 мл PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA.
3. Добавить 200 мкл MACS анти-CD4 микрошарики и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 минут.
4. Вымойте, добавив 40 мл PBS/2mM EDTA/0.5% BSA буфера и центрифуге при 250xg в течение 10 минут при 4 ° C. Слейте надосадочную и ресуспендируют в 8 мл дегазированной, комнатная температура PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA.
5. Фильтр-отдельной клеточной суспензии с использованием предварительно разделения фильтров, прежде чем загружать их на колонку LS.
6. Разделение суспензии клеток и слой 4мл каждого за калиброванный LS колонке (с 3 мл deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA). Л. С. колонки фиксируется в сепаратор MidiMACS. Перед суспензии клеток заканчивается, либо повторно запустить flowthrough или добавить 3 мл deggassed комнатной температуре PBS/2mM EDTA/0.5% BSA буфера и пусть проходят через буфер. Добавить больше буфер, пока он выйдет ясно.
7. Внесите 5 мл deggassed буфера на LS колонки, удалить LS столбца из сепаратора MidiMACS и поместить в новые стерильные 15 мл трубки коллекция позволяя ~ 1,0 мл пробегать. Поместите поршень в колонне и медленно толкать остальнойручки громкости.
8. Сделайте то же самое и с Л. С. колонн и объединить два CD4 + фракций. Добавить до 50 мл PBS и считать клетки. Ожидаемая доходность до 5х10 ⁸ клеток. Центрифуга на 400xg в течение 10 минут и ресуспендируют клетки также в 2 мл PBS/2mM EDTA/0.5% буфера BSA.

4. Флуоресцентные Активированный сортировки клеток (FACS) изоляции (рис. 2)

1. Сделайте коктейль из антител к CD маркеров для следующих поверхности клеток маркеры (хранить в защищенном от света): 20 мкл анти-человеческий CD8-FITC (клон РПА-T8), 20 мкл анти-человеческий CD14-FITC (клон M5E2; LPS рецептор), 20 мкл анти-человеческий CD32-FITC (клон FLI8.26; FcγR типа II) и 6 мкл анти-человеческого CD116-FITC (клон M5D12; GM-CSFRα цепи) и, наоборот, добавить 40μl анти -человеческий CD4-APCCy7 (клон РПА-T4).
2. Возьмите 5 мкл из 2 мл клеточной суспензии и пятна с 2μl пятен коктейль, это трубка для определения порога (флуорохромами минус один-FMO) ^5.
3. Добавить 50 мкл анти-человеческий CD25-PE (клон M-A251, Ил-2Rα), чтобы пятно коктейль, а также добавить коктейль для клеточной суспензии и инкубировать при температуре 4 ° С 30 минут. Вымойте клеток в PBS буфера, центрифуге при 400xg в течение 10 минут и ресуспендируют клетки к клетке концентрация 10 ⁷ / мл.
4. Подготовка неокрашенные клетки и клетки, окрашенные или шарики с одним флуорохромом для использования в качестве компенсации управления для сортировки клеток на FACS Ария (BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Нью-Джерси).
5. Приобретать клеток в трубке FMO, которая позволит пользователю установить порог для сортировки CD25 + Т-клеток (рис. 2а). Установить ворота вокруг FITC-негативные клетки, чтобы исключить FITC-положительных клеток включающий моноцитов, макрофагов и других лимфоцитов CD4 +-не-Т-клетки (рис. 2б).
6. В отдельном участке, сделать ворота для CD25-, CD25low и CD25high Т-клетки-Tregs (верхний 1% клеток, экспрессирующих наибольшее количество CD25) (рис. 2в). Сотовые подмножества правило, свидетельствуют о высокой чистоты (Рис. 2d, 2e и 2е).
7. Центрифуга коллекции трубки с клетками 400xg в течение 10 минут и держать их на льду до обшивки.

5. Настройка клеточных культур в 96-луночного планшета (схема приводится в табл.1) в 200μl/well

1. Алиготе 50 мкл CD3 покрытием бисером (1 мкг / мл), рассчитанный в 3 бисер / ответчик ячейки хорошо, ресуспендируют в полной среде с 10% объединенных человека АВ сыворотки в U-дно 96-луночных планшетах. (Например, чтобы сделать 2 мл среды с CD3, покрытые оболочкой, принимают 7.5μl из запаса CD3 покрытием бисером финал 4x10 концентрации ⁸ / мл и разбавить в 2 мл среды, каждый 50 мкл будет содержать 75000 beads-3beads/cell).
2. Развести облученных APC до 5х10 ⁵ / мл концентрации клеток и добавить 50 мкл (будет содержать 2,5 х 10 ⁴ клеток) в каждую лунку с ранее добавленного стимуляции, в том числе скважин помечены как "Tregs только", "APC только" и "средства массовой информации только" в таблице 1.
3. Добавить 2,5 х 10 ⁴ / а CD4CD25 или CD4CD25low Т-клеток в следующем трем образцам дизайна в таблице 1.
4. Добавить Tregs к сотрудничеству культур (строка B, таблица 1) в соотношении 1:10 (2500 Treg клетки), а также скважин помечены как "Tregs только" и инкубировать пластины при температуре 37 ° C в CO ₂ инкубаторе с 5% CO ₂ , в насыщенной влажности в течение 72 часов.
5. Импульсный скважин с 1μCi ^[3 H] тимидина и продолжают инкубацию при 37 ° С в течение следующих 16 часов.

6. Сбор и подсчет

1. Урожай клеток на многоэкранных пластины урожай использованием Packard filtermate комбайн или альтернативные системы.
2. Добавить сцинтилляционные жидкости (Microscint 20), накрыть крышкой уборки пластины с прозрачной пластиковой крышкой в ​​рамках подготовки к заключительному шагу.
3. Прочитано импульсов в минуту (CPM) / также использованием Top Граф NXT (Packard, КТ) или альтернативные системы.

7. Вычислительная процент подавления

1. Как клетки культивировали в трем образцам, среднее значение рассчитывается для каждого условия. Если коэффициент вариации составляет> 30%, выброс исключается и только копий в минуту из двух скважин усредняются. Процент подавления получается путем вычисления [(п) / с] х 100%, где S = копий в минуту в одной культуре и с = копий в минуту в совместной культуре.
2. Как наивны (CD25-) и в естественных условиях активирован (CD25low) эффекторные Т-клетки высевают в качестве ответчика Т-клеток, разница в способности Tregs подавить каждом из этих подмножеств захвачен и использован в качестве потенциальных функциональных показателей прогностической основывается на предпосылке, , что активированные клетки труднее подавить.

8. Представитель Результаты:

Великий изменчивости использованных методов и результатов, полученных в пробирке человеческих анализа подавления побудило нас провести всестороннее изучение условий, влияющих на анализе ^1. Мы разработали анализа, которая проверяет не только Treg функции, но и их чистота, учитывая низкое соотношение между Tregs: Teffs (1:10), который мы определили ранее ^6. Кроме того, Tregs отличаются йОДП способность успешно подавить наивно и в естественных условиях активированных Т-клеток, даже у здоровых людей, как показано на рисунке 3 и в наших предыдущих исследований, ^2,4, который становится более заметным, если иммунный баланс находится под угрозой, так как по предметам, на риск развития СД1 . Анализ работал очень хорошо в кабинете, где мы сравнили подавляющие функцию естественного (nTregs), индуцируемый (iTregs) и в пробирке расширен nTregs, что позволяет нам сравнить их функции между здоровыми управления, последние началом (RO) T1D и давние (LS ) T1D предметам. Мы пришли к выводу, что РО T1D испытуемые должны были лучше мощность производящего функционала и iTregs и расширена nTregs по сравнению с LS T1D и здоровой контрольной группе ^7. Таким образом, этот анализ может быть использована как отличный инструмент в признании как ранние и поздние состояния иммунного дисбаланса.

Схема 1 Схема презентация этапов в анализе подавление пробирке

Рисунок 1. Шаги в анализе подавление пробирке представлены с фотографиями

Рисунок 2. Память стратегии в изоляторе СУИМ. ) CD25 + порог был скорректирован в соответствии с флуорохромами минус один (FMO), б) клетки закрытого как FITC-отрицательных, в) FITC-негативные клетки были дополнительно закрытого типа, и собранные в CD + CD25-, CD + CD25low и CD + CD25high ( Tregs), показанные с процентами, г) FACS отсортированы Tregs после сортировки, е), FACS отсортированы CD + CD25low после сортировки, и е) FACS отсортированы CD4 + CD25-Т-клетки после сортировки

Рисунок 3. Представителю результаты здоровых людей) Представитель результаты импульсов в минуту (CPM) практически здоровых людей представлены в виде одной культуры для всех клеточных подмножеств участвует (наивно-CD25-, в естественных условиях активирован-CD25low, антиген-представляющих клеток, БТР и регуляторных Т-клеток-Treg), а также со-культур ответчик Т-клеток (CD25-или CD25low) и Tregs. б) Процент подавления каждого CD25-и CD25low ответчик Т-клеток путем аутологичной Tregs представляется для здоровой контрольной группой (п = 4). Подавление был рассчитан по формуле [(п) / с] х 100%, где S = копий в минуту в одной культуре и с = копий в минуту в совместной культуре. Хотя небольшая разница в мощности Tregs подавить ответчик Т-клеток, было замечено, он не был значительным (парный Т-тест р = 0,08). В) Представлены копии в минуту, по крайней риска предметов для каждой отдельной культуры, в том числе CD25-и CD25low как ответчик Т-клетки, а также АПК и Tregs, и сотрудничество культур, где каждая ячейка ответчик Т подмножество засеяно Tregs (CD25-/Tregs и CD25low/Tregs). г) Процент подавления каждого CD25-и CD25low ответчик Т-клеток путем аутологичной Tregs представляется для риску субъектов (п = 4). Разница в мощности Tregs подавить CD25-против CD25low ответчик Т-клеток было значительным (парный Т-тест р = 0,04).

Таблица 1. Схема настройка в анализе подавление пробирке

	1-3	4-6	7-9	10-12
	CD4CD25-	CD4CD25low	СМИ только	СМИ только
B	CD4CD25-/ Tregs	CD4CD25low / Tregs	Tregs только	APC только
C
D
E
F
G
H

Обсуждение

Как только уникальная особенность, чтобы Tregs, подавляющие функции должны быть проверены надежно и равномерно между субъектами на различных стадиях развития заболевания в пределах одного и между различными исследованиями. Мы предлагаем детали подавления анализ в нашей лаборатории, ка...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента или инструмента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Ficoll-Paque PLUS	Amersham Pharmacia Biotech	17-1440-03
DPBS-1X	Гибко	14190-144
Голубой Трипан	Invitrogen	15250-061
анти-CD4 микрошарики	Miltenyi	130-045-101
Предварительное разделение фильтры	Miltenyi	130-041-407
Л. С. колонке	Miltenyi	130-042-401
ЭДТА	Invitrogen	15575-020
BSA	Sigma-Aldrich	B4287
Анти-человека CD4-APCCy7 (клон РПА-T4)	BD Pharmingen	557852
Анти-CD25 человека-PE (клон M-A251, Ил-2Rα)	BD Pharmingen	555432
Анти-человека CD8-FITC (клон РПА-T8)	BD Pharmingen	555366
Анти-CD14 человека-FITC (клон M5E2; LPS рецептор)	BD Pharmingen	555397
Анти-CD32 человека-FITC (клон FLI8.26; FcγR типа II)	BD Pharmingen	555448
Анти-человеческого CD116-FITC (клон M5D12; GM-CSFRα цепи)	BD Pharmingen	554532
Dynalbeads М-450 tosylactivated	Invitrogen	140-13
Anti-CD3 человека	Анселл	144-024
Buffer1	Домашний		0,1 М Na 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2	Домашний		PBS/2mM ЭДТА / 0,1% BSA pH7.4
Buffer3	Домашний		0,2 М Tris/0.1% BSA pH8.5
Полное RPMI СМИ	Домашний		RPMI 1640 СМИ 2 мМ L-глутамина, 5 мМ HEPES 100 ед. / мкг / мл пени / strept 0,5 мМ пирувата натрия
[3 H] тимидина	Перкин Элмер	NET027Z005MC
человека объединенных AB сыворотке	Атланты биологические	S40110
Multiscreen пластины урожая	Millipore	MAHFC1H60
Microscint 20	Перкин Элмер	6013621