La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Resumen

Listeria monocytogenes es un organismo modelo para estudiar la respuesta inmune y la susceptibilidad genética a las bacterias intracelulares en ratones. Este método permite medir la carga bacteriana y generar una sola célula suspensiones de hígado y el bazo de los ratones para el análisis de FACS para determinar los cambios en las células inmunes, debido a la infección por Listeria.

Resumen

Listeria monocytogenes (Listeria) es un patógeno Gram-positivo intracelular facultativo ^1. Los estudios en ratones suelen emplear la inyección intravenosa de Listeria, lo que resulta en una infección sistémica ^2. Después de la inyección, Listeria difunde rápidamente en el bazo y el hígado debido a la absorción por CD8α ⁺ células dendríticas y las células de Kupffer ^3,4. Una vez fagocitadas, diversas proteínas bacterianas permiten Listeria para escapar del fagosoma, sobrevivir en el citosol, e infectar a las células vecinas ^5. Durante los tres primeros días de la infección, las diferentes células inmune innata (por ejemplo, los monocitos, neutrófilos, células NK, células dendríticas) intervienen en los mecanismos bactericidas que reducen al mínimo la proliferación de Listeria. Células T CD8 ^+, posteriormente reclutados y responsable de la liquidación final de Listeria desde el host, por lo general dentro de 10 días de la infección ^6.

Eliminación exitosa de Listeria a partir de ratones infectados depende de la aparición apropiada de las respuestas inmunitarias del huésped ^6. Hay una amplia gama de sensibilidades entre las cepas de ratones endogámicos ^7,8. En general, los ratones con una mayor susceptibilidad a la infección por Listeria son menos capaces de controlar la proliferación de bacterias, lo que demuestra aumento de la carga bacteriana y / o retraso en el aclaramiento en comparación con los ratones resistentes. Los estudios genéticos, incluidos los análisis de ligamiento y cepas knock-out mouse, se han identificado varios genes que la secuencia de variación afecta a las respuestas del huésped a la infección por Listeria ^6,8-14. Determinación y comparación de la cinética de la infección entre las diferentes cepas de ratón es tanto un método importante para la identificación de factores genéticos que contribuyen a la respuesta inmune contra la listeria. La comparación de las respuestas del huésped a diferentes cepas de Listeria es también una forma efectiva de identificar los factores de virulencia de bacterias que pueden servir como blancos potenciales para la terapia con antibióticos o el diseño de vacunas.

Se describe aquí un método sencillo para medir la carga bacteriana (unidades formadoras de colonias [UFC] por tejido) y la preparación de una sola célula suspensiones de hígado y el bazo de FACS análisis de la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria. Este método es especialmente útil para la caracterización inicial de la infección por Listeria en las cepas de ratón novela, así como la comparación de la respuesta inmune entre diferentes cepas de ratón infectado con Listeria. Usamos la Listeria monocytogenes EGD cepa ¹⁵ que, cuando se cultivaron en agar sangre, presenta una zona de halo alrededor de cada colonia característico debido a la β-hemólisis ¹ (Figura 1). La carga bacteriana y la respuesta inmune se puede determinar en cualquier punto de tiempo después de la infección por el homogeneizado cultivo de tejidos en placas de agar sangre y la preparación de suspensiones de células de tejido para análisis FACS utilizando los protocolos descritos a continuación. Queremos hacer notar que las personas que están inmunocomprometidas o las mujeres embarazadas no deben manipular Listeria, y el correspondiente comité de bioseguridad institucional y manejo de los animales instalación debe ser consultado antes de comenzar el trabajo.

Protocolo

1. Cultivo y largo plazo de almacenamiento de Listeria monocytogenes (Listeria)

1. Hacer o comprar pre-hechos caballo de agar sangre (HBA) placas. Placas secas antes de su uso por los pre-incubación a 37 ° C durante la noche o la colocación de descubierto en una cabina de flujo laminar durante 1 hora.
2. Obtener viable Listeria de uno de los siguientes: un homogeneizado de tejido infectado del ratón, un stock liofilizado, un stock de glicerol congelado, o una colonia de un cultivo de Listeria reciente (es decir, menos de una semana de edad y no sub-cultivadas más de 10 generaciones) . Todos Listeria se debe obtener con un bucle de inoculación estéril y el empleo de técnicas asépticas para todos los métodos descritos en este protocolo.
3. Racha de Listeria en una placa HBA como se muestra en la Figura 1 mediante un bucle de inoculación estéril: Listeria racha de más de ¼ de la superficie de la placa como la propagación del inóculo primario. Hacer una serie de rayas unidireccional de la propagación primaria. Repita 2-3 veces rayando con un bucle frescos o re-esterilizados antes de cada conjunto de rayas. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
4. Tienda de Listeria placa HBA a 4 ° C por un período máximo de 1 mes o ir al paso de 1,5 a preparar para la cultura Listeria almacenamiento a largo plazo.
5. Elija una sola colonia de un cultivo de Listeria fresco en una placa HBA con un asa de inoculación esterilizada y se inoculan 10 ml de infusión cerebro-corazón (BHI) caldo (prepare de acuerdo a las instrucciones del fabricante) en un frasco de 30 ml McCartney.
6. Incubar el cultivo de Listeria en un agitador orbital a 180rpm a 37 ° C durante la noche.
7. Añadir glicerol estéril al 80% (v / v) a la cultura Listeria líquido en proporción de 1:1 para obtener una concentración final de glicerol del 40% (v / v). Transferencia de 0,5-1 ml alícuotas en crioviales y almacenar reservas Listeria / glicerol a -70 ° C.

Consejos y notas:

• El crecimiento de Listeria se puede apoyar en diferentes medios no selectivos, tales como una amplia gama de agar sangre (complementado con caballos, ovejas, cuyes o sangre humana), la infusión cerebro corazón (BHI) o agar caldo o caldo de soja tríptico con la levadura extracto (TSB-YE). El crecimiento de contaminantes puede ser minimizado en la cultura mediante la adición de antibióticos a los medios de comunicación para las cepas de Listeria con la resistencia a los antibióticos definido (por ejemplo, L. monocytogenes 10403S), o mediante el uso de los medios de comunicación de Oxford, que selectivamente apoyar el crecimiento de Listeria.
• Si Listeria se obtiene de una fuente no probados, se recomienda que las pruebas adicionales se realizaron para confirmar la identidad de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes es Gram positivo, no forman esporas, móviles a <30 ° C, anaerobios facultativos, catalasa positivos, y oxidasa negativa). El cultivo obtenido también pueden ser cultivadas en medios selectivos Listeria para asegurarse de que un cultivo puro se obtiene.
• Secado de las placas HBA asegura que hay una separación óptima de colonias de bacterias en la placa.
• Al hacer reservas congeladas de glicerol de la Listeria, el uso fresco culturas HBA Listeria que son menos de 1 semana de edad y sub-cultivadas por las generaciones pocos como sea posible (<5 es el mejor).
• Al derivar nuevas culturas Listeria a partir de un stock de glicerol congelado, el primer paso debe ser en medio sólido (es decir, placas HBA) por Listeria se obtienen de poblaciones de glicerol congelado crecen débilmente cuando se subcultivan directamente en un medio líquido.

2. Preparación y el almacenamiento de las acciones infecciosas de Listeria en los estudios de infección in vivo

1. Racha de Listeria a partir de un stock de glicerol congelado (Paso 1.7) sobre una placa HBA como se describe en el paso 1.3. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche para al día siguiente.
2. Elija una colonia de Listeria único de la cultura y la racha de inocular a 10 ml de caldo BHI. Evitar la transferencia de agar en el caldo.
3. Incubar la Listeria cultura BHI en un agitador orbital a 180 rpm y 37 ° C a mediados de la fase logarítmica (OD600 = ~ 0,4). Esto suele tardar de 3-4 horas.
4. Tomar una alícuota de 0,9 mL aséptica y obtener una lectura de DO a 600 nm en las 3-4 horas de agitación. Si OD lectura es <0,3, y luego continuar a la cultura en un agitador orbital a 180 rpm y 37 ° C hasta que la lectura de OD es de ~ 0.4.
5. Añadir 1 ml estéril 80% de glicerol (v / v) a 10 mL Listeria cultura caldo BHI (OD600 ~ 0,4). Mezclar suavemente y transferir a tubos de 1,5 ml de microcentrífuga en alícuotas de 0,5 a 1 ml.
6. Coloque las alícuotas sobre el hielo durante 10 minutos y almacenar a -70 ° C. Deje una alícuota congelada para determinar la concentración de Listeria en el stock infecciosa, que es típicamente del orden de 10 ⁹ UFC / mL.
7. Realizar diluciones seriadas 1:10 de la unfrozen acciones Listeria infecciosas en PBS a 10 ^-8 dilución. 100 L de propagación sin diluir y de cada dilución posterior a un secado previo placas HBA (paso 1.1) por duplicado, con un esparcidor de vidrio. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
8. Cuente el número de colonias en cada placa y determinar la concentración de Listeria de la cultura de valores infecciosas congelados mediante el siguiente cálculo: la concentración (UFC / mL) = número de colonias x factor de dilución / 0,1 ml. Las placas elegido para contar lo ideal sería tener 30 a 300 colonias para garantizar una estimación fiable de la concentración de UFC de bacterias viables.
9. Pocos días después de la conservación de existencias infecciosa Listeria a -70 ° C, descongelar un tubo. Determinar la concentración de Listeria viable como se describe en los pasos 2.7 y 2.8. Esta concentración debe ser similar a la fijada para el archivo recién preparada infecciosas en el paso 2.8.

Consejos y notas:

• Acciones infecciosa Listeria se congela a un glicerol menor porcentaje (8%) que para Listeria congelados general a largo plazo de almacenamiento (40%).
• Frozen acciones infecciosa Listeria son generalmente estables a -70 ° C hasta por 3 meses. Si se utiliza más de 3 meses, se recomienda que una acción infecciosas nuevas prepararse a partir de una cultura de Listeria fresco en una placa HBA.
• Si la concentración de las acciones descongelado infecciosa Listeria (paso 2.9) es diferente de las acciones recién preparada como se describe en los pasos 2.7 y 2.8 (es decir, disminución de> 20% en el UFC), entonces un nuevo archivo infecciosas congelados deben estar preparados.
• Aunque el tiempo inicialmente más lenta que la preparación de un inóculo bacteriano fresco para un solo experimento, la preparación de las existencias congeladas infecciosa Listeria permite una determinación exacta de la concentración de UFC antes de la infección y una mayor coherencia entre los experimentos en ratones están infectados del stock congelado misma.

3. Preparación del inóculo de Listeria y la inyección intravenosa de ratones

1. Determinar la concentración de Listeria que se inyecta por ratón. Para la inyección intravenosa, UFC en 200 l de inóculo por ratón se utiliza.
2. Descongelar una alícuota de congelados de las acciones infecciosa Listeria (del Paso 2.6). Diluir el stock infecciosas en PBS a la concentración deseada Listeria UFC. El doble del volumen necesario para la inyección de todos los ratones para asegurar que haya suficiente inóculo para la inyección y la determinación de la Listeria UFC antes y después de la inyección (paso 3.3 y 3.7).
3. Quitar 2x 0,1 mL alícuotas del inóculo Listeria preparado, y preparar una dilución 1:10 en PBS para cada alícuota antes de la inyección de los ratones. Placa de 0,1 ml de cada dilución en placas HBA, e incubar las placas durante la noche a 37 ° C. Cuente el número de colonias y determinar la pre-inyección de la concentración del inóculo de Listeria: concentración (UFC / mL) = (número de colonias x factor de dilución) / mL plateado para que el factor de dilución.
4. Transferir el ratón para ser inyectado en una jaula limpia. Caliente el ratón mediante la colocación de la jaula de aproximadamente 50 cm bajo una lámpara infrarroja de 250 vatios durante 5 minutos (otros dispositivos adecuados térmica que no se quema el ratón o el aumento de la temperatura de la caja por encima de 40 ° C también se puede utilizar). Coloque el ratón en un dispositivo de retención para las inyecciones de vena de la cola.
5. Mezclar suavemente la suspensión de Listeria para mantener una suspensión constante cada vez que se carga una jeringa.
6. Localizar la vena lateral de la cola del ratón, limpie suavemente con un 70% de etanol limpiar e inyectar 200 uL de inóculo de Listeria (a una concentración deseada) con una jeringa con una aguja de calibre 27. En pocas palabras aplicar presión en la herida de entrada con una gasa estéril. Devolver el ratón a su jaula.
7. Cuando la inyección de todos los ratones se ha completado, repita el paso 3.3 con la cantidad restante de inóculo para determinar la concentración después de la inyección del inóculo de Listeria.
8. La cantidad de producto Listeria en ratones se presenta como el promedio de UFC determina a partir de la pre-y post-inyección muestras de inóculo Listeria.

Consejos y notas:

• Por lo general se inyectan 500 - 3.000 UFC (200 l de 2.500 UFC / ml - 15.000 UFC / mL de inóculo) al comparar la carga bacteriana y la respuesta inmune entre una cepa de ratones resistentes (por ejemplo C57BL / 6) y una cepa de ratones susceptibles (por ejemplo, BALB / c ).
• Si la acción infecciosas se diluyeron en PBS por lo menos 10 ^5, y luego una fase de lavado generalmente no se requiere retirar el papel residual / glicerol. Si la acción infecciosa no se diluye en PBS por lo menos 10 ^5, y luego una fase de lavado se debe agregar en el paso de 3,2 a eliminar los medios de comunicación residual / glicerol como sigue: Add 9 ml de PBS para abastecerse descongelado bacterias infecciosas y recogidas por centrifugación a 2100 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células bacterianas sedimentaron en 10 ml de PBS estéril, repetir la centrifugación y se resuspenden las células bacterianas de pellets en el volumen deseado. Determinar el promedio de UFC de la pre-y post-inyección muestras de inóculo Listeria como se describe en el Paso 3.3 y 3.7. Cabe señalar que este paso de lavado puede resultar en una pérdida de las bacterias, y se recomienda que dicha pérdida se determinará de antemano y cuenta en la toma del inóculo de concentración requerida.
• Descartar de forma segura la jeringa y la aguja después de inyectar un ratón con Listeria.

4. La eliminación de hígado y el bazo de ratones infectados con Listeria para el análisis

1. Euthanase el ratón infectado en el punto deseado de tiempo después de la infección usando un método aprobado por el Comité de Ética Animal locales, tales como la asfixia de CO _2.
2. Realizar sangrar cardiaca inmediatamente después de la eutanasia con una jeringa de 1 ml y aguja de calibre 25. Recoger la sangre tanto como sea posible. Quitar la vesícula biliar y cortar la vena cava inferior.
3. Exponer la vena porta hepática empujando cuidadosamente los intestinos a la derecha, dar la vuelta a los lóbulos del hígado hacia la cabeza y hacia la izquierda para que el hígado está sentado en el diafragma se encuentra. La vena porta hepática se introduce en la parte inferior del hígado a partir de la parte inferior derecha.
4. Perfundir el hígado mediante la inyección de 10 ml de PBS en la vena porta hepática con una aguja de calibre 26. PBS inyectado a través de la vena porta se cortó la salida de la vena cava inferior. La perfusión del hígado se asegura de que las células recolectadas son el hígado y no la sangre circulante.
5. Quitar el hígado perfundido de la cavidad del cuerpo del ratón, en lugar de tampón FACS, y almacenar en el hielo. Ir al paso 5.1 para la preparación del hígado para el análisis de FACS.
6. Extirpar el bazo del ratón, el lugar en tampón FACS, y almacenar en el hielo.
7. Pesar el bazo entero, cortado por la mitad, y con un peso una de las mitades. Colocar la mitad en tampón FACS y vaya al paso 6.1. Coloque la otra mitad en una bolsa Stomacher en el hielo y vaya al paso 7.1.

Consejos y notas:

• En los pasos 4.5 y 4.6, el uso de tampón FACS suficientes para sumergir completamente el tejido para minimizar la exposición de cualquier parte del tejido al aire.
• A ½ pulgadas de largo aguja de calibre 26 que se dobla en un 30 º mejor puede facilitar la inyección de PBS en la vena porta hepática.
• Cuando se perfunde adecuadamente, el hígado se vuelve de un color rojo oscuro a marrón claro después de inyectar 1.2 ml de PBS.
• Si el hígado no es necesario para el análisis FACS, la perfusión no es necesario. El hígado puede ser aislado y se recoge directamente en una bolsa Stomacher y procesada como se describe en el paso 7.
• Para la eutanasia de los ratones, asfixia de CO ₂ es el método preferido porque tiene un impacto mínimo en UFC de bacterias y viabilidad de las células inmunes en el bazo y el hígado. Si la extracción de sangre no es necesaria, la dislocación cervical puede ser utilizado como método de eutanasia alternativa. Se recomienda que no los métodos de eutanasia que pueden afectar el peso del órgano o de la viabilidad celular inmune a ser utilizado (por ejemplo, tiobarbitúricos).

5. Preparación de la suspensión de células hepáticas para el análisis de FACS

1. Generar una sola célula suspensiones mediante la colocación de hígado con tampón FACS (paso 4.5) en un filtro de 70 micras de células que se encuentra dentro de 60 mm placa de Petri. Empujar el tejido a través del filtro de células con el émbolo de una jeringa de 5 ml hasta obtener una suspensión de una sola célula se forma.
2. La transferencia de la hepática única suspensión de células de la placa de Petri a un cónico de 50 ml con tapón de rosca del tubo y obtener un volumen total de 40 ml de frío tampón FACS.
3. Vortex suspensión celular y tomar una parte alícuota de 1 ml para determinar la carga bacteriana por el hígado. Vaya al paso 7.3 y el uso de esta alícuota de 1 ml, en lugar de homogeneizado de tejido en la bolsa de Stomacher.
4. Precipitar las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 40 ml de tampón FACS frío, que sedimenten las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C, y desechar el sobrenadante.
5. Resuspender el botón celular en 20 ml de Percoll isotónico a temperatura ambiente. Centrifugar la suspensión celular a 700 g durante 12 minutos a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y hoja de disco como de células flotando en la superficie (es decir, los hepatocitos). Resuspender el pellet de leucocitos que contiene 4 ml de buffer de TAC para lisar los eritrocitos y las células se incuban a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos con la inversión frecuentes.
6. Suspensión de células a través de una membrana de filtro de 100 micras de nylon en un nuevo tubo de centrífuga de 10 ml.
7. Subyacente filtrada suspensión de células con 1 ml de FCS / EDTA. Centrifugar a 350 g durante5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante y se resuspenden en 5 ml FACS / EDTA.
8. Centrifugar la suspensión celular a 350 g durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular en 0,5-3 ml de FACS / EDTA en función del tamaño de la pastilla.
9. 01:05-01:20 diluir la suspensión celular en azul tripán dependiendo del volumen de la suspensión en el paso 5.8. Contar leucocitos viables hepática con hemocitómetro (Figura 4) y determinar el total de células viables de la siguiente manera: las células viables / órgano = número de células en el factor de dilución área de conteo x ⁴ x 10 x volumen (ml). El hígado de una sola célula suspensiones puede ser marcadas con anticuerpos específicos para la deseada de la superficie celular los marcadores y analizada por FACS.

Consejos y notas:

• Mantener las células en hielo a menos que se especifique lo contrario.

6. Preparación de una sola célula del bazo de suspensión para el análisis de FACS

1. Generar una sola célula suspensiones mediante la colocación de una media del bazo (paso 4.7) con tampón FACS en un colador de 70 micras de células que se encuentra dentro de un plato de Petri de 60 mm. Empuje suavemente el tejido a través del filtro de células con el émbolo de una jeringa de 5 ml hasta obtener una suspensión de una sola célula se forma.
2. Transferir el bazo única suspensión de células de la placa de Petri a un tubo de centrífuga de 10 ml y un volumen total de 10 ml con tampón FACS frío.
3. Precipitar las células por centrifugación a 350 xg durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, resuspender pellet de células en 4 ml de tampón TAC para lisar los eritrocitos y las células se incuban a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos con la inversión frecuentes.
4. Suspensión de células a través de una membrana de filtro de 100 micras de nylon en un nuevo tubo de centrífuga de 10 ml.
5. Subyacente filtrada suspensión de células con 1 ml de FCS / EDTA. Centrifugar a 350 xg durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular en 5 ml FACS / EDTA.
6. Centrifugar la suspensión celular a 350 g durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y resuspender el sedimento celular en 3.8 mL FACS / EDTA en función del tamaño de la pastilla.
7. Diluir 1:10 de células en suspensión - 1:20 en azul tripán (0,4% en agua destilada) dependiendo del volumen de la suspensión en el paso 7.6. Contar con esplenocitos viables con hemocitómetro - vea el Paso 5.9 para calcular el total de células viables por órgano del bazo de una sola célula suspensiones puede ser marcadas con anticuerpos específicos para la deseada de la superficie celular los marcadores y analizada por FACS.

Consejos y notas:

1. Mantener las células en hielo a menos que se especifique lo contrario.

7. La medición de la carga bacteriana en los tejidos de ratones infectados con Listeria

1. Doble la parte superior de la bolsa de Stomacher que contiene la mitad del bazo. Mientras se mantiene la bolsa Stomacher cerrada para evitar fugas, déjelo sobre un banco limpio o en una cabina de flujo laminar. Rollo de un picadero de espesor sobre el tejido hasta que el tejido se tritura dentro de la bolsa.
2. Añadir 5 ml de PBS a cada bolsa Stomacher tejido que contiene puré. Coloque la bolsa en el Stomacher Stomacher, y ejecutar el Stomacher a alta velocidad durante 10 minutos.
3. Mezclar el homogeneizado en la bolsa de Stomacher (o la alícuota de 1 ml de la suspensión de células hepáticas) con una pipeta. Realizar las siguientes en los duplicados. Transferencia de 300 L a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Dentro de los pozos de la placa de 96 pocillos realizar diluciones seriadas 1:10 (30 l 270 l en PBS) a una dilución 10 ^-5 para cada muestra de tejido homogeneizado.
4. Extiende con cuidado 0,1 ml de cada dilución en una placa de pre-secado HBA con un esparcidor de vidrio. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
5. Cuente el número de UFC por cada dilución y calcular el UFC por tejido teniendo en cuenta la parte del tejido (por ejemplo medio del bazo), factor de dilución y el volumen total del homogeneizado de tejido (5 ml o 40 ml): UFC / tejido = CFU/0.1 ml x factor de dilución x ml / tejidos, por el bazo dividir este número por el peso porcentual de la muestra utilizada para la homogeneización del bazo tejido (véase el paso 4.7).

Consejos y observaciones:

• Más de una bolsa Stomacher se puede colocar en el Stomacher a la vez, siempre y cuando el volumen total no exceda el volumen máximo especificado por el fabricante
• Si un Stomacher no está disponible, un homogeneizador de tejidos se pueden utilizar en su lugar. Por otra parte, el siguiente método, aunque no son tan eficientes, también se puede utilizar para macerar manualmente el órgano en el lugar de los pasos 7.1 y 7.2: órgano lugar en un sobre sellado bolsa de plástico esterilizada y se echó en un banco limpio mientras se mantiene la bolsa cerrada para evitar fugas . Rollo de 500 ml botella de vidrio de laboratorio repetidamente sobre la bolsa hasta que el tejido esté bien triturado. Añadir 5 ml de PBS a cada bolsa y vaya al paso 7.3.
• Es muy importante en el paso 7.4 que las placas HBA se secan completamente(Es decir, no hay humedad en el agar). De lo contrario, puede ser difícil de obtener distintas colonias de Listeria que puede ser contado correctamente.
• Si hay un número limitado placas HBA, un paso alternativo 7.4 es: Dibujar líneas en la parte inferior de una placa de pre-secado HBA (Paso 1.1) para dividirlo en cinco a seis secciones, una para cada dilución. Cuidadosamente con una pipeta 25 l de cada dilución en secciones correspondientes en la placa HBA para cada homogeneizado de tejido - no se propagan con una espátula. Espere hasta que las gotas de homogeneizado de tejido se seca antes de invertir la placa. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Hasta 80 colonias se pueden distinguir por una gota en una placa de agar.
• Dilución de los homogeneizados de tejido puede depender del crecimiento de Listeria en el animal y se puede estimar sobre la base de que los síntomas mostrados por el animal en el momento de la eutanasia. En los ratones que son notablemente moribunda, entonces diluciones adicionales pueden ser necesarios para determinar con mayor precisión la carga bacteriana. De los ratones inoculados con dosis bajas de Listeria o ratones sacrificados al final del periodo de infección, homogeneizado de tejido sin diluir se puede utilizar para determinar la carga bacteriana.
• Las placas pueden ser incubadas a 37 ° C durante la noche oa temperatura ambiente durante 2-3 días.

8. Los resultados representativos:

Para un experimento de infección estándar, Listeria fue obtenida de una reserva de glicerol congelado y sembradas en una placa HBA como se muestra en la Figura 1. Si algunas colonias se obtienen después de rayas, esto puede indicar rayas pobres o menos de stock congelado óptima. Una acción infecciosa Listeria se preparó a partir de una placa HBA recién rayado y se almacenan a -70 ° C. Para la medición de la eliminación de bacterias y la respuesta inmune, de manera rutinaria diluir el descongelado acciones infecciosa Listeria a 2.500 UFC / ml - 15.000 UFC / ml y se inyectan ratones con 200 l para infectarlos con 500 - 3.000 UFC. Observamos que los ratones infectados con dosis subletales de Listeria con este protocolo de forma transitoria pueden presentar pelaje rizado, postura encorvada y la pérdida de peso en los primeros días. Estos síntomas proporcionar una señal visual en cuanto a la severidad con un ratón individual se ve afectada por la infección, si se responde de manera diferente al resto del grupo (es decir, "evidente" outlier), y si la eutanasia es necesaria para evitar un sufrimiento excesivo y la muerte inminente debido a la infección.

En los resultados representados en las figuras 2-5, los ratones fueron infectados con una alícuota recién descongelado de las acciones infecciosa Listeria. En diferentes momentos después de la infección, los ratones fueron sacrificados y el hígado y el bazo fueron removidos. La figura 2 muestra una placa HBA en el que se cultivó homogeneizado diluido el bazo de un ratón. Debe haber una clara reducción en el número de colonias como el factor de dilución es mayor, de tal manera que contando UFC distinta es posible que al menos dos diluciones. Si el ratón se ha eliminado la infección por Listeria (límite de detección, es decir = 100 UFC / tejido), entonces <5 colonias de Listeria estará presente en la placa HBA que se extendió con 200 l de homogeneizado de tejido sin diluir. Si el hígado y / o el bazo se contaminan con bacterias externas intestinal o de otro tipo durante el aislamiento, las colonias en la placa HBA es probable que exhiben morfología diferente (es decir, no tienen aureola característica y color pálido de las colonias de Listeria) y / o se puede diferentes en el recuento de colonias a lo que se espera para Listeria (es decir, muy pocos o demasiados). La Figura 3 muestra una curva típica de autorización Listeria en ratones C57BL / 6 - Listeria en cuenta que normalmente se eliminan más rápidamente del bazo que el hígado y que la remoción no se produce hasta cinco días después de la infección.

La Figura 4 muestra el recuento de células sobre la base de una sola célula suspensiones preparadas a partir de bazo y el hígado de los ratones infectados en diferentes momentos después de la infección. Este método puede alcanzar> 95% de pureza de leucocitos en una sola célula suspensiones preparadas a partir de hígado y> 80% del bazo. La pureza de leucocitos puede ser determinada por el análisis FACS utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el marcador pan-leucocitario CD45 (clon 30-F11). Normalmente, el número de esplenocitos y leucocitos hepática aumento durante el período que se tarda en eliminar la infección con el hígado presentan un mayor aumento en los leucocitos veces hepática, pero un total considerablemente menor, en comparación con el aumento de esplenocitos en el bazo. El tipo y número de las células inmunes se puede determinar mediante el etiquetado, las suspensiones de una sola célula con anticuerpos específicos para los marcadores de la superficie celular. Células marcadas se puede detectar mediante análisis de FACS. La Figura 5 ofrece resultados representativos de células T CD8 ^+. Durante una infección por Listeria estándar en ratones C57BL / 6, el número de células T CD8 ⁺ transitoriamente disminuye debido a la linfopenia en el bazo en los días 2-3 before incrementar notablemente desde el día 5 después de la infección, tanto en el bazo y el hígado.

Figura 1. Placa HBA rayado con Listeria. Un bucle de inoculación estéril se utilizó para racha de Listeria a partir de un stock de glicerol congelado. La placa se incubó a 37 ° C durante la noche. El halo alrededor de las colonias características individuales se debe a la β-hemólisis.

Figura 2. Tejido homogeneizado de un ratón Listeria infectadas cultivadas en placas de HBA. El hígado fue extraído de un C57BL Listeria infectados / ratón 6 a los 3 días post-infección. Homogeneizado de tejido fue preparado y colocado diluciones de 100 l placa completa difusión de dilución 10 ^-4 (A) y 10 ^-5 dilución (B), así como 25 gotas l en una placa HBA para cada dilución de 1:10 de diluir a 10 ^-5 (C). Las placas se incubaron a 37 º C durante la noche. Las diluciones que permitan el recuento de colonias individuales se utilizan para determinar la carga bacteriana (es decir, UFC / tejido) en ese punto en el tiempo post-infección.

Figura 3. Listeria carga en el bazo y el hígado de los ratones infectados C57BL / 6 a 3 y 7 días post-infección. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con ~ 2000 UFC de Listeria. En cada momento, los ratones fueron sacrificados, el hígado fue perfundido y se cosecha con el bazo, y las diluciones del homogeneizado esplénico (A) o hepática única suspensión de células (B) se cultivaron en placas HBA para determinar la carga bacteriana. Las líneas continuas indican la media geométrica, y las barras verticales indican SEM. La línea punteada indica que el límite de detección para una medición precisa de la carga bacteriana es de 100 UFC / órgano de este experimento.

Figura 4. Recuento de células viables para los tejidos de los ratones infectados. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con ~ 2000 UFC de Listeria. En cada momento, los ratones fueron sacrificados y perfundidos el hígado y se cosecha con el bazo. Las células se tiñeron con azul de tripano y contó con un hemocitómetro como se describe en el Paso 5.9 (A). Esplenocitos de leucocitos (B) y hepática (C) recuentos obtenidos a partir de una sola célula suspensiones preparadas a partir de ratones infectados con Listeria. Las líneas indican la media geométrica.

Figura 5. FACS análisis de células T CD8 ⁺ en ratones infectados con Listeria. Ratones C57BL / 6 fueron infectados con ~ 2000 UFC de Listeria. En cada momento, los ratones fueron sacrificados y perfundidos el hígado y se cosecha con el bazo. Una sola célula suspensiones fueron teñidas con anticuerpos específicos para las células T (CD3, TCRβ, CD4 y CD8). (A) Representante de los perfiles de FACS con% linfocitos T CD8 ⁺ + / - SEM. (B) Total de células T CD8 ⁺ en el bazo. (C) Total de células T CD8 ⁺ en el hígado.

Discusión

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria⁶. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)^16-18.

There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.

Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.

This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells¹⁹, characterize dendritic cells²⁰, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection^21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Caballo de agar sangre base de N º 2	Oxoid	CM0271	Preparación de la base de agar de placas HBA
La sangre de caballo (desfibrinada)	Oxoid	HB1000	Añadir un 5-10% a base de agar
Infusión cerebro corazón (BHI) caldo (10 ml)	Oxoid	TM456
Cerebral media de infusión de corazón deshidratado	Oxoid	CM1135
Placa de 96 pocillos de fondo plano	BD Biosciences	353072
70 m de células colador	BD Biosciences	352350
Pequeña placa de Petri	BD Biosciences	351007
Stomacher 80 Biomaster laboratorio de sistema de	Seward
Bolsas de plástico Stomacher	Sarstedt	86 9924 530
Albúmina de suero bovino	Sigma	A3912
Tampón FACS			0,1% (w / v) de albúmina sérica bovina en PBS
Percoll isotónico (33,75% Percoll en PBS)	GE Healthcare	17-0891-01	33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, PBS 1x 62.5mL hace 100 ml de Percoll isotónico
TAC Buffer			Tris 17 mm, 140 mm de cloruro de amonio en agua destilada
FCS / EDTA			Suero fetal bovino con 10 mM EDTA
FACS / EDTA			Tampón FACS + 5 mM EDTA
El azul tripán	Sigma	T6146	0,4% (w / v) en PBS, esterilizada por filtración
2 ml criovial	Greiner Bio One	121263
27 jeringa de insulina gauge/1mL	Terumo Medical Products	SS10M2713
Aguja	Terumo Medical Products	NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
Jeringa	Terumo Medical Products	SS-01T (1 ml), SS-053 (5 ml), SS-10S (10 ml)