Riconoscimento della transglutaminasi epidermica da IgA e 2 anticorpi transglutaminasi tissutale in un raro caso di Rhesus Dermatite

Riepilogo

Dermatite erpetiforme (DH) è una condizione infiammatoria cronica caratterizzata da una reazione autoimmune tra IgA e transglutaminasi epidermica (ETG). DH si sviluppa in una porzione molto piccola di pazienti glutine-sensibile e / o celiaci. I risultati di questo studio indicano che DH può anche svilupparsi in un ospite scimmia rhesus con i sintomi della dermatite idiopatica.

Abstract

Transglutaminasi tissutale 2 (tTG2) è un enzima digestivo intestinale che deamidates già parzialmente digerito dietetici senza glutine peptidi della gliadina ad es. Nei soggetti geneticamente predisposti, tTG2 innesca reazioni autoimmuni che si caratterizzano per la produzione di anticorpi tTG2 e la loro deposizione diretta in piccoli ^1,2 parete intestinale. La presenza di questi anticorpi costituisce una delle caratteristiche principali della malattia celiaca (MC). Transglutaminasi epidermica (ETG) è un altro membro della famiglia transglutaminasi che può anche funzionare come un autoantigene in una piccola minoranza di pazienti con CD. In questi casi relativamente rari, ETG innesca una reazione autoimmune (rash cutaneo), clinicamente conosciuta come la dermatite erpetiforme (DH). Sebbene l'esatto meccanismo della patogenesi CD e DH non è ben compreso, è noto che tTG2 e ETG epitopi antigenici parti che possono essere riconosciuti dagli anticorpi nel siero dei pazienti sia da CD e DH ^3,4.

(Macaca mulatta) con dermatite (Tabella 1, fig. 1 e 2) è stato utilizzato per studiare i tessuti colpiti. In un animale (EM96) una sovrapposizione spettrale di IgA e gli anticorpi tTG2 (Fig. 3) è stata dimostrata. La presenza del doppio positivo tTG2 + IgA + cellule è stata focalizzata nell'epidermide profonda, intorno alla papilla dermica. Ciò è coerente con le lesioni descritte in pazienti con DH ^3. Quando EM96 è stato posto su una dieta priva di glutine, la dermatite, così come tTG2 + IgA + depositi scomparsi e non erano più rilevabili (fig. 1-3). Dermatite riapparve tuttavia, sulla base di re-introduzione del glutine nella dieta in EM96 (non mostrato). Nei macachi altri tra cui animali con dermatite non correlate, il + tTG2 depositi IgA + non sono stati rilevati. Dieta priva di glutine-dipendente remissione della dermatite in EM96 insieme con presenza di tTG2 + IgA + cellule sua pelle suggeriscono una autoimmune, DH-likemeccanismo per lo sviluppo di questa condizione. Questo è il primo rapporto del DH-come dermatite in qualsiasi primate non umano.

Protocollo

1. Biopsia cutanea raccolta dei campioni

1. Prima della procedura di biopsia della pelle, anestetizzare gli animali per via intramuscolare con 2,5 mg / kg di cloridrato tiletamina e cloridrato miscela zolazepam telazol (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Monitorare gli animali dalla somministrazione di anestetici fino decubito e poi rimuovere dal loro recinto.
2. Rimuovere i capelli dalla zona cutanea di interesse utilizzando un Oster d'Oro Clipper A5 Single Speed ​​veterinaria con una lama taglia 40 (Oster Professional Products, McMinnville, TN) e asetticamente preparare con alternanza di macchia Betadine e alcol. Fissare un telino sterile fenestrato il sito selezionato biopsia.
3. Usando una tecnica sterile, posizionare un 4,0 millimetri Miltex strumento Punch biopsia cutanea (Miltex, York, PA) contro la pelle mentre si ruota lo strumento di 180 gradi in senso orario e antiorario con una leggera pressione fino a quando la biopsia transetti attraverso gli strati dermici nella ti sottocutaneossue. Rimuovere il campione bioptico e afferrare la porzione di pelle sezionato con una pinza e libero dai tessuti sottocutanei.
4. Chiudere il difetto pelle con 3-0 sutura in nylon collegato a un ago 3 / 8 cerchio di taglio (Ethilon, Ethicon, la Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, Regno Unito) in uno schema crociato. Dare tutti gli animali 0,01 mg / kg buprenorfina cloridrato (Hospira, Lake Forest, IL) per via intramuscolare per la post operatorio analgesia.

2. Esempio di lavorazione

1. Lavora con biopsia campioni di pelle da dermatiti croniche e sani di controllo macachi rhesus. Ottenere 2-3 (4 mm di diametro) da campioni di biopsie ogni animale.
2. Fissare primo campione in formalina di zinco (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) per 24 ore, lavare in acqua per 30 minuti, lavare brevemente in etanolo al 70%, e il luogo in ASP300 processore tessuto Leica (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS), dove il tessuto è disidratato con gradi ascendenti del 70%, 80%, 95% e il 100% di etanolo 48min ciascuno (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), seguita da due cambi di xilene (Fisher).
3. Incorporare nei media paraffina (Fisher) a lungo termine conservazione a temperatura ambiente. Posto a -20 ° C per 20 minuti prima di sezionamento. Preparare 6 sezioni micron utilizzando un microtomo rotativo (HM325, Microm internazionale, Waldorf, Germania). Luogo sezioni su vetrini carica (Fisher) e aria secca a 60 ° C durante la notte. Colorare con ematossilina e eosina (H & E) metodo standard (descritta sotto).
4. Fix secondo campione nel 2% paraformaldeide (USB Corp, Cleveland, OH) per 30 minuti a temperatura ambiente, lavare tre volte in tampone fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), posto nel 30% di saccarosio (Fisher) per 4 ore, e incorporare nel medio congelamento ottobre (Sakura Finetek, Torrence, California). Mantenere a-80 ° C per 20 minuti prima di sezionamento. Preparare 15 sezioni micron utilizzando il criostato (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).

3. H & E colorazione

1. Sparaffinare incorporaresezioni ded attraverso tre cambi di xilene (Fisher) e reidratare attraverso etanoli classificato: tre cambi del 100%, due cambi del 95%, una variazione del 80% e acqua distillata, 2 min ciascuna.
2. Colorare con ematossilina (Richard Allan-scientifico, Kalamazoo, MI) per un minuti e seguite da un lavaggio breve in acqua corrente.
3. Contrasto con eosina (Sigma) per 6 min.
4. Disidratare i tessuti colorati con il 95% ed etanolo assoluto, due cambi di 2 minuti ciascuna e quindi in chiaro tre cambi di xilene, 3 minuti ciascuno.
5. Monte coprioggetti usando Cytoseal Media di montaggio (Richard Allan-scientifico), il H & E-sezioni di tessuto colorato.

4. La valutazione istopatologica

Ispezionare H & E-macchiato sezioni biopsia cutanea sotto un microscopio ottico con il 4 - 40x di ingrandimento e microscopio Leica con una SPOT Insight fotocamera digitale (Digital Instruments Inc., Michigan, USA).

5. Stai immunofluorescenzaNing

1. Lavora con ottobre-embedded sezioni pelle per la colorazione di immunofluorescenza. Prima della colorazione, ammollo per 20 minuti in PBS contenente 0,2% di pesci pelle gelatina (FSG, Sigma) con il 0,1% Triton X-100 (Sigma) per rimuovere il PTOM e permeabilize il tessuto.
2. Dopo aver lavato le diapositive, incubare con siero di capra 10% normale (NGS, Sigma), diluito in PBS-FSG per 1 ora a temperatura ambiente, in una camera umidificata scivolo.
3. Per visualizzare la deposizione di IgA e gli anticorpi tTG2, incubare diapositive con anti-Rhesus tTG2 IgA e gli anticorpi primari, diluiti in 10% NGS-PBS-FSG per 1 ora.
4. Lavare con PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) per 10 minuti, seguita da PBS-FSG per 10 min.
5. Incubare con secondaria, isotipo-specifici anticorpi taggati con fluorocromo Alexa Fluor 488 (verde), 568 (rosso) o 633 (blu) (Molecular Probes-Invitrogen) alla diluizione 1:1000. Utilizzare il ToPro-3 colorante per visualizzare il DNA nucleare. Usare il 10% di NGS-PBS-FSG come diluente dell'anticorpo.
6. Utilizzare la soluzione anti-spegnimento (Sigma) per montare le sezioni di tessuto colorato.

6. Confocale di imaging

Eseguire l'imaging con un microscopio Leica TCS SP2 vera confocale a scansione laser (Leica, Wetzlar, Germania) dotato di tre laser (sei linee di eccitazione disponibile): un argon-krypton laser a 488 nm (verde), un laser kripton a 568 nm ( rosso) e di elio-neon laser a 633 nm (blu), che spaziano dal visibile al far-rosso lato dello spettro. Record contrasto differenziale di interferenza (DIC) immagini per la valutazione della non etichettati architettura dei tessuti.

7. Rappresentante Risultati

Un esempio di riconoscimento positivo di ETG sia tTG2 e gli anticorpi IgA è mostrato in fig. 3A. Coerenti con la situazione nei pazienti umani e per la prevalenza molto più bassa di DH-come dermatite di tipo CD sensibilità al glutine anche nei macachi rhesus, la maggior parte dei campioni di biopsia cutanea si prevede che show la reazione positiva con tTG2 anticorpi, ma senza la presenza di tTG2 + IgA + cellule doppio positive (Fig. 4). Questi DH-correlate casi, inclusi i casi la dermatite di origine microbica, rivelerà alcuni single-cellule positive + IgA dispersi sotto l'epitelio ma non sovrapposizione spettrale tra le tTG2 e IgA marcata con marcatori (Fig. 3B e 4). Pertanto, è importante mantenere l'ordine delle procedure di test suggerito, iniziando con l'esame clinico (Fig. 1), seguita dalla valutazione istopatologica (Fig. 2) e solo se nessun altro, che causano dermatiti più comuni agenti possono essere identificati, confocale esame microscopico di biopsie cutanee colorate per tTG2 e IgA è giustificata. Valutazioni cliniche e / o istopatologiche da soli non sono sufficienti per una diagnosi positiva di questa condizione. Nei casi in cui doppio-positivi (tTG2 + IgA +) le cellule sono identificate intorno alla zona della papilla dermica, DH-come la diagnosi di dermatite può essere rilasciato. In questi casi, il ritiro del glutine nella dietae la somministrazione di dieta priva di glutine è consigliata al fine di alleviare i sintomi di dermatite.

Figura 1. Regione inguinale di EM96 macaco prima (A) e dopo (B) ritiro del glutine nella dieta per 5 settimane. Reintroduzione del glutine nella dieta ha coinciso con la ricomparsa della dermatite (C).

Figura 2. HE colorazione di EM96 biopsie cutanee macaco raccolti prima (A) e dopo (B) ritiro del glutine nella dieta per 9 settimane. R: Epitelio è addensato (7-15 strati di cellule epiteliali) con una spessa crosta superficiale di cellule infiltrate ipercheratosiche con neutrofili degenerando. I neutrofili appaiono anche dentro l'epitelio e si mescolano con i numeri moderata dei linfociti, plasmacellule, istiociti e in tutto il annessi nel derma superiore. B: Alcuni hyperkeratOsis è ancora presente, lo spessore epiteliale è normalizzato (4-7 strati) con il minimo di infiltrazione linfoplasmacellulare nel derma superiore. C: Normale cute addominale da FR56 macaco, senza alcuna infiltrazione linfoplasmacellulare, si effettua il confronto. Ingrandimento 20x.

Figura 3. Immagini di microscopia confocale di EM96 biopsie cutanee macaco raccolti prima (A) e dopo (B) ritiro del glutine nella dieta per 9 settimane. R: IgA colorazione (verde), tTG2 (rosso) e ToPro-3 marcatore del DNA nucleare (blu). Co-localizzazione di IgA e tTG2 appare in giallo intorno alla zona di papilae cutanea. B: campione di pelle presa dopo 9 settimane di dieta priva di glutine non mostra IgA all'interno dell'epitelio mentre alcuni sottoepiteliale IgA è ancora presente (verde), tTG2 (rosso) e ToPro-3 marcatore del DNA nucleare (blu).

Figura 4. immagini di microscopia confocale di GI24 biopsie cutanee macaco rhesus raccolti durante animale stava esibendo i sintomi della broncopneumopatia cronica (DH-correlati) dermatite. La colorazione IgA è in verde, tTG2 in rosso e ToPro-3 marcatore del DNA nucleare è in blu. Le cellule + tTG2 sono presenti all'interno del epitelio, pochi IgA + cellule sotto l'epitelio, mentre non sovrapposizione ampio spettro tra i marcatori rosso e il verde si vede.

Animal Tag	Sesso [M / F]	Età [Anni]	I sintomi clinici	Plasma tTG2 anticorpi	Dieta [1,2] *
HJ71	F	1,3	Sano	-	1
HD13	M	1,4	Sano, diarrea occasionale	+	1
FR56	M	5,4	Diarrea cronica idiopatica	-	1
EM96	F	5.0	Dermatite cronica	+ / - (Borderline)	1 e 2
GI24	F	4,6	Dermatite cronica	-	1

Tabella 1. TNPRC macachi rhesus utilizzati per la raccolta di biopsie cutanee

* Dieta 1 - regolare scimmia chow (contenenti glutine); dieta 2 - dieta senza glutine

Discussione

La nostra nuova costituzione non umani modello primate della sensibilità al glutine è stato recentemente utilizzato per studiare i cambiamenti della permeabilità intestinale innescato da glutine ^5,6. Plasma tTG2 anticorpi così come intestinali tTG2 depositi IgA + + sono stati rilevati in alcuni glutine-sensibile macachi. Da quando abbiamo recentemente identificato episodi rari di dermatiti idiopatiche nella colonia di macachi rhesus, dove non sempre (infettivo / metabolica) eziologia è stato possibile st...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente o attrezzature	Azienda	Numero di catalogo / Codice Prodotto	Nota
Anti-Human IgA FITC *	Sigma, St. Louis, MO	F-5259	1:100 diluizione di lavoro
Anti-Human tTG2	Thermo Scientific, Kalamazoo, MI	MS-300-P1ABX	1:100 diluizione di lavoro
Anti-Mouse IgG1 **	Invitrogen, Carlsbad, CA	A-21124	1:1000 diluizione di lavoro
ToPro-3 *** sonda DNA	Invitrogen, Carlsbad, CA	T-3605	1:1000 diluizione di lavoro
Zinco formalina (Z-fix)	Anatech Ltd., Battle Creek, MI	171
Ottobre di congelamento Medio	Sakura Finetek, Torrence, California	4583
Cytoseal di montaggio Medio	Richard Allan-scientifico, Kalamazoo, MI	8312-4
Anti-Tempra Soluzione	Sigma, St. Louis, MO	P 3130
Ethilon (Sutura in nylon)	Ethicon, la Johnson & Johnson, Berkshire, Regno Unito	663G
Miltex Punch Strumento biopsia cutanea	Miltex, York, PA	NA
Oster Golden A5 singola Vet tagliatore di velocità con una lama taglia 40	Prodotti Oster, McMinnville, TN	78005-050
Leica tessuto del processore	Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS	ASP300
Microtomo rotativo	Microm internazionale, Waldorf, Germania	HM325
Criostato	Thermo Scientific, Kalamazoo, MI	HM560
Microscopio confocale	Leica, Wetzlar, Germania	TCS SP2