Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

Riepilogo

Le cellule endoteliali che formano colonie (ECFCs) sono cellule endoteliali circolanti con una robusta potenziale proliferativo clonale che mostrano intrinseca In vivo capacità di formazione. Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali escrescenza derivate da CB sono importanti per identificare ed isolare Bona fide ECFCs per il potenziale applicazione clinica nella riparazione di tessuti danneggiati.

Abstract

Viste di vecchia data della formazione di nuovi vasi sanguigni attraverso l'angiogenesi, vasculogenesi e arteriogenesi sono stati recentemente rivisti ^1. La presenza in circolo di cellule progenitrici endoteliali (EPC) sono stati identificati nel sangue periferico umano adulto da Asahara et al. Nel 1997 ² portando un'infusione di nuove ipotesi e strategie per la rigenerazione e la riparazione vascolare. EPC sono componenti rari, ma di normale circolazione del sangue, che ospita i siti di formazione dei vasi sanguigni o di rimodellamento vascolare, e facilitare sia vasculogenesi post-natale, l'angiogenesi, o arteriogenesi in gran parte attraverso la stimolazione paracrina della parete del vaso esistente derivato cellule ^3. Nessun marcatore specifico per identificare un EPC è stato identificato, e al momento lo stato del campo è quello di capire che tipi di cellule tra cui numerosi proangiogenica staminali e cellule progenitrici ematopoietiche, cellule circolanti angiogenici, Tie2 ⁺ monociti, cel progenitore mieloidels, tumore macrofagi associati, e M2 macrofagi attivati ​​partecipare stimolare il processo angiogenico in una varietà di sistemi preclinici modelli animali e in soggetti umani in numerosi stati di malattia ^{4, 5.} Le cellule endoteliali che formano colonie (ECFCs) sono rare cellule vitali endoteliali circolanti caratterizzate da una forte potenziale proliferativo clonale, colonia secondaria e terziaria capacità di formazione su replating, e la capacità di formare intrinseca in vasi vivo dopo il trapianto in topi immunodeficienti ^6-8. Mentre ECFCs sono state isolate con successo dal sangue periferico di soggetti adulti sani, sangue del cordone ombelicale (CB) di neonati sani e parete del serbatoio di numerosi vasi arteriosi e venosi umane ^6-9, CB possiede la più alta frequenza di ECFCs ⁷ che mostra il più robusto potenziale proliferativo clonale e la forma dei vasi sanguigni durevoli e funzionali in vivo ^{8, 10-13.} Sebbene la derivazione diECFC adulto da sangue periferico è stato presentato ^{14, 15,} qui si descrivono le metodologie per la derivazione, clonazione, l'espansione, e in vitro e in vivo caratterizzazione del ECFCs dal ombelicale umano CB.

Protocollo

Reagenti e soluzioni

EMG-2 supporti (Lonza, N. di cat. Cc-3162 contenente EBM-2 medio basale e EGM-2 Supplementi kit SingleQuot, e fattori di crescita)

EBM-2 (Lonza, Cat.. No. cc-3156) integrato con gli integratori intero kit SingleQuot e fattori di crescita (Lonza, Cat.. No. cc-4176), 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) penicillina (10.000 U / ml) / streptomicina (10.000 pg / ml) / amfotericina (25 pg / ml). Memorizza fino a 1 mese a 4 ° C. Consigliati EGM-2 volumi da utilizzare per la cultura ECFC sono 500 pl / bene per piastre da 24 pozzetti, 2 ml / pozzetto per le piastre da 6 pozzetti, le 5ml/25-cm ² boccette, e 10 ml/75-cm ² boccette, a meno che diversamente specificato nel protocollo.

Collagene I soluzione

Diluire 0,575 ml di acido acetico glaciale (17.4N) in 495 ml di acqua distillata sterile (0,02 N concentrazione finale). Filtro sterile l'acido acetico diluito con un 0,22-um vacuum sistema di filtraggio. Aggiungere 25 mg coda ratto collagene I, l'acido acetico diluito ad una concentrazione finale di 50 pg / ml. La quantità di collagene aggiunta varia a seconda della concentrazione magazzino collagene. Memorizza fino a un mese a 4 ° C.

Preparazione delle superfici dei tessuti collagene I rivestite cultura

Luogo 1 ml di collagene I soluzione in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti per coltura tissutale (utilizzare 300 pl / pozzetto di piastre da 24 pozzetti, le 3ml/25-cm ² flaconi e 8 ml/75-cm ² beute). Incubare per 1 ora a notte a 37 ° C. Rimuovere il collagene I soluzione e lavare la superficie due volte, ogni volta con PBS (500 utilizzare pl / pozzetto di piastre da 24 pozzetti, 2 ml / pozzetto di piastre da 6 pozzetti e 5ml/25-cm ² flaconi e 10 ml/75 cm ² palloni). Utilizzare le piastre immediatamente per colture cellulari.

FACS colorazione tampone

Tampone fosfato salino (PBS) addizionato con 2% (v / v) di siero fetale bovino (FBS). Negozio di up per 2 settimane a 4 ° C.

A. ECFC escrescenza, clonazione e di espansione

1. Raccogliere CB con eparina (10 U di eparina / ml di sangue) o EDTA come anticoagulante e il trasporto al laboratorio a temperatura ambiente e immediatamente (entro 2 ore di consegna bambino) di processo per il campione di cellule mononucleate (MNC) isolamento.
2. Aliquotare 15 ml di CB in ogni 50 ml provetta conica da centrifuga e aggiungere 20 ml di PBS in ogni provetta di volte CB e pipetta diversi per miscelare. Redigere 15 ml Ficoll-Paque in una siringa da 20 ml e inserire un ago 20G o cannula di miscelazione. Posizionare la punta della cannula di miscelazione sul fondo del tubo di sangue diluito e accuratamente sottostrato 15 ml Ficoll-Pague. Centrifugare le provette 30 min a 740 xg, a temperatura ambiente, senza la regolazione del freno decelerazione.
3. Usando una pipetta di trasferimento, rimuovere lo strato nebuloso di bassa densità MNC situato all'interfaccia tra il plasma Ficoll-Paque e diluito. Erogare le multinazionali in un 50 ml cont tubo conicoaining 10 ml EGM-2 media. Centrifugare le multinazionali 10 min a 515 xg, a temperatura ambiente, con una impostazione alta del freno decelerazione.
4. Aspirare accuratamente e scartare il surnatante. Lavare le cellule pellet con EGM-2 due volte (10 min a 515 xg) e risospendere le multinazionali in EGM-2 a 1.25 x 10 ⁷ cellule / ml. Preparare collagene I rivestite piastre a 6 pozzetti di coltura tessutale aggiungendo 1 ml di coda di topo collagene di tipo I (50 ug / ml) per pozzetto e incubando la piastra notte. Pipettare 4 ml di questa sospensione MNC in ciascun pozzetto e posizionare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore umidificato. A.1.5) Dopo 24 ore (giorno 1), rimuovere lentamente il mezzo trascorso (non disturbare le cellule aderenti liberamente) dal pozzo con una pipetta, aggiungere lentamente 4 ml EGM-2 al pozzo, e tornare piastra nell'incubatore . Il giorno 2, il mezzo di aggiornamento lentamente rimuovere il mezzo (non disturbare le cellule aderenti liberamente) dal pozzo con una pipetta e l'aggiunta di 4 ml EGM-2 in ciascun pozzetto. Ripetere il supporto cambio giornaliero delle Nazioni Unitetil giorno 7 ed ogni altro giorno in seguito, fino colonie ECFC appaiono per la clonazione. In genere le colonie appaiono tra il giorno 5 e giorni 14 giorni ⁷ (Fig. 1).
5. Visualizza tipiche colonie ECFC con morfologia ciottolo con microscopio invertito (ingrandimento 10x) e delimitano colonia con un marcatore sul lato inferiore del pozzo per indicare la posizione di ogni colonia.
6. Il giorno 14, lavare queste colonie primarie 2 volte con PBS e le colonie di raccolta individuali utilizzando cilindri di clonazione e di quel tanto che basta Triplo espresso per coprire le cellule all'interno dei cilindri. Dopo aver aspirato il lavaggio finale della PBS, posizionare un cilindro sterile clonazione rivestito gel intorno ad ogni colonia e premere con forza contro la piastra con pinza sterile. Aggiungere 2-3 gocce di caldo Triplo esprimono in ogni cilindro clonazione e incubare per 3-5 minuti finché le cellule all'interno del cilindro cominciano a staccarsi. Aggiungere circa 250 microlitri medio EGM-2 nel centro del cilindro e pipettare su e giù per generate sospensione di cellule singole. Trasferire la sospensione di cellule singole da ciascun cilindro clonazione separatamente in un singolo micro-provetta da centrifuga.
7. Lavare l'area all'interno dei cilindri 2-3 volte con circa 250 microlitri EGM-2 mezzo per raccogliere tutte le cellule rimanenti e trasferire il lavaggio da ciascun cilindro al rispettivo micro-provetta da centrifuga. Centrifugare le celle ad alta velocità (≤ 300 xg) a centrifuga da tavolo per 5 min.
8. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1,5 ml fresco EGM-2 media. Trasferire la sospensione cellulare (contenente tutte le celle da singole colonie) da ciascuna provetta in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per coltura tissutale pre-rivestite con 500 pl collagene I coda di topo (50 ug / ml).
9. Luogo all'interno dell'incubatore per l'espansione con i media cambiano eseguita a giorni alterni.
10. Quando le cellule avvicinarsi 80-90% di confluenza, rimuovere il terreno speso poi lavare le cellule 2 volte con PBS e aggiungere 500 microlitri Triplo media espressa in ogni pozzettodel 24-pozzetti di coltura tissutale. Posizionare la piastra all'interno della incubatore per 3-5 minuti fino a quando le cellule iniziano a radunare e staccare. Aggiungere 1 ml di EGM-2 (con 10% FBS definito) a ciascun pozzetto per raccogliere le cellule mediante lavaggio e trasferirli ad una provetta da 15 ml. Lavare il bene con 1 ml EGM-2 di media per raccogliere tutte le cellule rimanenti e trasferire il lavaggio di ogni bene nel rispettivo tubo di 15 ml. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min.
11. Rimuovere il medio e risospendere il pellet di cellule in 1 ml fresco EGM-2 media (con il 10% FBS definito). Ottenere il numero di cellule vitali di una aliquota utilizzando un emocitometro e trypan esclusione blu.
12. Espandere le cellule mediante inseminazione di circa 5000 cellule / cm ² su un collagene I pre-superfici rivestite di tessuto di coltura in EGM-2 media con i media cambiano ogni due giorni fino a quando le cellule avvicinarsi 80-90% confluenza prima sub-coltura di nuovo.

B. In vitro Caratterizzazione fenotipica delle ECFCs: Endothelial espressione sulla superficie cellulare Antigen unod Assay singola cella per clonale potenziale proliferativo

1. Per endoteliale espressione di antigeni di superficie cellulare, staccare le cellule con Triplo espresso per raccogliere le cellule utilizzando i metodi descritti per la clonazione ECFC ed espansione.
2. Risospendere le cellule in colorazione tampone FACS (10 x 10 ⁶ cellule / FACS colorazione 1ml di buffer), quindi aggiungere reagente FcR blocco (20 pl / 10 X 10 ⁶ celle), mescolare delicatamente e il luogo in ghiaccio per 10 min.
3. Aliquotare 100 microlitri di questa sospensione di cellule in micro-centrifuga provetta per ciascun antigene di superficie endoteliale e controlli isotipici. Aggiungere quantità appropriata di fluorocromi marcati anticorpi umani monoclonali che riconoscono gli antigeni endoteliali (CD31, CD144, CD146, e CD105) o antigeni ematopoietiche (CD45, CD14 e) e lasciare su ghiaccio per 30 minuti al riparo dalla luce. Attenzione: 1 x 10 ⁶ cellule non sono necessari per ogni test. Gli autori preparano tipicamente da 0,5 a 1 x 10 ⁵ cellule / provetta per ottenere 2 X 10 ⁴ analizzared eventi. Inoltre, seguire la raccomandazione del produttore per la quantità di anticorpi da utilizzare per ogni test. Alcuni anticorpi possono richiedere la titolazione per determinare la concentrazione ottimale di anticorpi. Tutto colorazione che gli autori si sono esibiti sono colorazione unico colore.
4. Dopo 30 min di incubazione in ghiaccio, centrifugare ciascun tubo ad alta velocità in una centrifuga da tavolo per 5 min quindi rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di cellule in tampone FACS.
5. Analizzare i campioni su un citometro di flusso per determinare la percentuale di cellule che macchia positivamente o negativamente per ciascun antigene. ECFCs colorare uniformemente positive per CD31, CD144, e CD146, ma negativo per CD45 e CD14 rispetto ai controlli isotipici corrispondenti.
6. Per l'analisi singola cella per esaminare il potenziale proliferativo clonale, staccare il passaggio precoce (2-3) cellule con Triplo espresso per raccogliere le cellule usando metodi simili che è stato descritto per la clonazione ECFC ed espansione.
7. Infect queste cellulecon una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) che esprime lentivirus ¹⁶ e raccogliere le cellule che esprimono EGFP in citometria a fluorescenza. Attenzione: Lavorare con i lentivirus è considerato un rischio biologico e tutti i bio-sicurezza precauzioni devono essere rispettate.
8. La cultura come descritto per ECFC coltura nella sezione per l'espansione ECFC.
9. Preparare collagene I rivestite piastre da 96 pozzetti aggiungendo 50 pl coda di topo collagene di tipo I (50 ug / ml) per pozzetto ed incubare la piastra per una notte. Raccogliere i ⁺ ECFCs EGFP utilizzando Triplo Express e risospendere in EGM-2 di medie dimensioni con concentrazione finale ~ 10 ⁶ cellule / ml.
10. Utilizzare FACS Vantage (Becton Dickson) o altro separatore comparabile con bassa portata di 20 cellule / secondo per ordinare un unico EGFP ⁺ ECFC per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e regolare il volume finale di 200 pl per pozzetto con EGM-2. Utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per garantire che ogni pozzetto ricevuto una sola cella. Alternatively, singole cellule possono essere ordinati in base FSC e SSC e Sytox colorante nucleare colorazione, le colonie possono essere utilizzati per punteggio cella e quantificazione.
11. Incubare la piastra per un periodo di due settimane con due cambi di media (200 pl EGM-2 pipettatore multicanale utilizzando) eseguite il giorno 5 e giorni 10. Il giorno 14 della coltura, lavare ciascun pozzetto con 100 pl PBS prima di fissare le cellule con 100 pl di paraformaldeide al 4% per 30 min. Per ECFCs che non esprimono EGFP, il reagente Sytox, un colorante fluorescente verde nucleare, dopo fissazione paraformaldeide e incubare a 4 ° C per una notte.
12. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per esaminare ciascun pozzetto per quantificare il numero di cellule endoteliali che espansi da una singola cellula in coltura per 14 giorni. Per l'analisi quantitativa, pozzi punteggio con 2 o più cellule endoteliali come positivo (per la proliferazione) ed esaminare ulteriormente per la conta totale delle cellule endoteliali mediante conteggio visivo con il microscopio a fluorescenza.
13. Per visualizzare tha ottenuto dati, pozzi con un numero di cellule endoteliali: da 2 a 50, 51-2000, e 2001 o più, sono considerate: gruppi di cellule endoteliali, a basso potenziale proliferativo (LPP)-ECFCs, e l'elevato potenziale proliferativo (HPP) - ECFCs rispettivamente. ECFCs esporre gerarchia completa del potenziale proliferativo clonale, dando origine a grappoli endoteliali, LPPS e centrali è quando coltivate a livello di singola cellula per 14 giorni. ⁷

C. In vivo Caratterizzazione funzionale degli ECFCs: test in vivo la formazione dei vasi ad esaminare i potenziali del ECFC per vasculogenesi

1. Preparare il gel cellularized calcolando il volume totale (ml) di ciascuno dei seguenti materiali gel (con la concentrazione finale in parentesi) necessaria per lanciare 1-ml gel (che sarà poi diviso in due per generare 2 impianti): FBS (10 %), EBM-2 10:01 (regolare il volume finale di 1 ml), bicarbonato di sodio (1,5 mg / ml), NaOH (pH a 7,4), HEPES (25 mM), fibronectin (100 pg / ml), e collagene I (1,5 mg / ml).
2. Dopo il calcolo gel materiale, staccare le cellule con Triplo espresso per raccogliere le cellule usando metodi simili che è stato descritto per la clonazione ECFC ed espansione. Ottenere un conteggio di cellule vitali di una aliquota utilizzando un emocitometro e trypan blu. Trasferire 2,4 milioni di cellule vitali in un ml-conica tubo da 50 e agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 515 xg, temperatura ambiente. Allo stesso tempo, preparare la soluzione gel matrice con l'aggiunta di volumi calcolati di HEPES, bicarbonato di sodio, EBM-2 10:1, FB, fibronectina e collagene ad una ghiacciata da 50 ml tubo conico (nello stesso ordine in cui sono elencati). Mescolare bene e regolare il pH a 7,4 con NaOH mantenendo soluzione sul ghiaccio.
3. Eliminare il supernatante dalle cellule dopo centrifugazione e risospendere il pellet in 360 pl caldo EGM-2 e ad esso aggiungere pH regolato 840 pl di soluzione di matrice gel, rendendo il volume finale di 1 ml dell'impianto gel. Mescolare le cellule in soluzione di matrice gel lentamente finocellule sono completamente sospesi nella soluzione di gel.
4. Trasferire questa ml 1 gel in sospensione cellularized ad un pozzetto di 12 pozzetti di coltura e incubare per 20-30 min fino a quando il gel polimerizza. Delicatamente coprire il gel con 2 ml caldo EGM-2 ed incubare una notte.
5. Immediatamente prima l'impianto, bisecare il gel durante la notte incubato in due parti uguali con le forbici iris e restituire i pezzi gel alla stessa cultura pozzetto contenente EGM-2 media.
6. Utilizzare la funzione animale chirurgica per sedare l'animale (5-6 settimane di età topi NOD / SCID) mediante la somministrazione di anestesia isoflurano. Shave la parte inferiore dell'addome e pulire accuratamente il sito chirurgico con tamponi imbevuti di alcool e antisettico Betadine o altro. Poi isolare la zona con tende secondo le linee guida IACUC e istituzionale.
7. Uso sterili forbici affilate iride di effettuare una incisione circa 5 mm nel quadrante inferiore dell'addome, esponendo lo spazio sottocutaneo tra la pelle ei muscoli addominali. Eseguire blunt-dissezione attraverso lo strato dermico dal muscolo addominale per creare una tasca 15-20 mm di larghezza superiore che conduce nel quadrante addominale superiore. Ripetere la procedura simile per creare simili tasca aperta in un altro lato dell'addome del mouse stesso.
8. Inserire un pezzo metà di gel in un lato della tasca addominale e un altro pezzo mezzo di gel in un altro lato della tasca addominale sollevando lo strato dermico appena caudalmente l'incisione.
9. Dopo l'inserimento di gel, chiudere ogni incisione con 2-3 punti di sutura in polipropilene con 5-0 su un ago di taglio. Opportunamente etichettare le carte gabbia ed eseguire il monitoraggio post-chirurgica e analgesia in conformità ai requisiti istituzionali e di protocollo e permettere 14 giorni per le cellule impiantate in questi gel per generare de novo vascolarizzazione.
10. Infine, il raccolto delle protesi in gel viene in genere eseguita 14 giorni dopo l'impianto dopo l'eutanasia il mouse.
11. Strofinare l'area addominale con tamponi imbevuti di alcool etagliare la pelle addominale caudale alla linea di incisione originale. Con cautela, sezionare l'impianto da escissione un lembo di pelle al caudale probabile localizzazione del gel. Excise l'impianto tagliando attorno alla circonferenza della gel poi mettere in fissativo di zinco (BD Biosciences, seguire la raccomandazione del produttore per ottenere risultati ottimali) e consentire loro di fissare per 1-2 ore a temperatura ambiente.
12. Preparare i paraffina gel utilizzando protocolli standard istochimiche e preparare le sezioni 5 um su vetrini per eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina, anti-CD31 umano o di topo anti-CD31 per visualizzare la vascolarizzazione all'interno del gel. ECFCs sottoposti vasculogenesi de novo a generare vasi umanizzati in cellularized protesi in gel inserito in topi immunodeficienti per 14 giorni ^4,8,11.

D. Risultati rappresentativi

Utilizzando questa tecnica derivazione ECFC abbiamo osservato fuori la crescita della forma principale coloniazione fin dal giorno 5 (Fig. 1). Gli out-colonie di crescita ECFC esposto aspetto tipico acciottolato e ha dato origine a> raddoppi su 40 popolazioni di espansione a lungo termine dopo pickup colonia clonazione. Estese colonie espresso antigeni endoteliali, ma non esprimere antigeni ematopoietiche (Fig. 2). È importante sottolineare che, esibivano una gerarchia completa di clonale potenziale proliferativo a livello di singola cellula (Fig. 3). Inoltre, ECFCs formata vasi sanguigni umanizzati che vengono perfuse con RBC host quando impiantato in topi immunodeficienti ^{4, 6, 8, 11} (Fig. 4).

Figura 1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) dal sangue del cordone ombelicale e la conseguenza della formazione di colonie delle cellule endoteliali (ECFCs) colta da multinazionali. Strato di forma buffy coat multinazionali durante la separazione Ficoll-Pague gradiente di densità delle cellule del sangue del cordone. Isolamento dello strato di buffy coat per la cultura delle multinazionali sulla coda di topo collagene I risultati piastre rivestite in conseguenza della colonia ECFC in 5 a 14 giorni. La colonia ECFC escrescenza (indicato da punte di freccia) visualizzate morfologia ciottoli ^7.

Figura 2. Rappresentante in vitro valutazione fenotipica di endoteliale e ematopoietiche espressione degli antigeni di superficie cellulare. Immunofenotipizzazione del sangue del cordone ombelicale-derivati ​​ECFCs ha rivelato che ECFCs espresso antigeni endoteliali CD31, CD34, CD144 e CD146, Flt-1, Flk-1, Flt-4 e Nrp2 ma non esprimere antigeni ematopoietiche CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 o AC133 ^{7, 8.}

Figura 3. Rappresentante quantificazione in vitro del clonogenica e potenziale proliferativo del CB ECFCs derivati. (A) dal sangue del cordoneDerivati ​​dal ECFCs visualizzare clonale potenziale proliferativo con una gerarchia di colonie che vanno da gruppi di 2-50 cellule fino a colonie di> 2001. (B) Micrografie di gerarchia delle colonie (colonie macchiato, Sytox, un colorante fluorescente verde nucleare per scattare foto di migliore qualità) ottenuto dopo il sangue del cordone derivati ​​ECFCs sono stati coltivati ​​a livello di singola cellula per 14 giorni. Barra della scala rappresenta 100μm ^{7, 8.}

Figura 4. Rappresentante in vivo caratterizzazione funzionale di cordone ombelicale-derivati ​​ECFCs. A) H & E colorazione del sangue del cordone ombelicale-derivati ​​ECFC contenente protesi in gel cellularized indicato microvasi (riempito di globuli rossi ospiti) la formazione di collagene-fibronectina gel dopo 14 giorni dall'impianto. B) Anti-CD31 umano colorazione (colorazione marrone) conferma ulteriormente l'origine umana di questi vasi.

Discussione

Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule progenitrici endoteliali putativi è importante identificare le ECFCs buona fede che sono in grado di clonale serialmente re-placcatura in coltura e dare origine a durevoli e funzionali vasi sanguigni impiantabili in vivo. Sangue del cordone ombelicale umano si arricchisce di ECFCs e la concentrazione di queste cellule circolanti diminuisce con l'invecchiamento o malattia ^10. Recenti studi suggeriscono che ECFC può giocare un ruolo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
Iniezione di sodio eparina, USP	APP Pharmaceuticals	504031
Ficoll-Pague	Amersham Biosciences	17-1440-03
Cannula di miscelazione	Maersk Medical	500.11.012
EGM-2	Lonza	CC-3162
Definito FBS	Hyclone	SH30070.03
Triplo express	Gibco	12605
Rat collagene di tipo I	BD Biosciences	354236
Matrigel	BD Biosciences	356234
FcR Block	Miltenyi Biotech	130-059-901
hCD31, FITC coniugazioneTed	BD Pharmingen	555445
hCD45, coniugato FITC	BD Pharmingen	555482
hCD14, coniugato FITC	BD Pharmingen	555397
hCD144, PE coniugato	eBioscience	12-1449-80
hCD146, PE coniugato	BD Pharmingen	550315
hCD105, PE coniugato	Invitrogen	MHCD10504
Ms 1 IgG, anticorpi k, coniugato FITC	BD Pharmingen	555748
Ms 1 IgG, anticorpi k, coniugato con PE	BD Pharmingen	559320
Ms IgG 2a, anticorpi k, coniugato FITC	BD Pharmingen	555573
Anti-CD31 umano	Dako	clone JC70 / A
Anti-mouse CD31	BD Pharmingen	553370
0,22-um vuoto sistema di filtrazione	Millipore	SCGPU05RE
Acido acetico glaciale, 17.4N	Pescatore	A38-500
Antibiotico-antimicotica	Invitrogen	15240-062
Siero bovino fetale (FBS)	Hyclone	SH30070.03
IHC zinco Fixative	BD Biosciences	550523
Sytox verde reagente	Invitrogen	S33025
Cilindri clonazione, sterili	Fisher Scientific	07-907-10