내피 콜로니 형성 세포의 Phenotypic 및 기능성 특성은 인간 탯줄의 혈액에서 유래

요약

내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs) 본질을 표시하는 강력한 clonal proliferative 잠재력과 내피 세포를 순환하고 있습니다 생체내에서 함선 능력을 형성. CB에서 파생된 가지 내피 세포의 Phenotypic 및 기능적 특성 식별하고 격리하는 데 중요 어딘가에서 손상된 조직을 복구에서 잠재적인 임상 응용을위한 ECFCs.

초록

angiogenesis, vasculogenesis 및 arteriogenesis 통해 새로운 혈관 형성의 오랜 전망은 최근 ^1을 검토하고있다. 내피 전구 세포 (EPCs)를 순환의 존재가 처음 Asahara 외 의해 성인이 인간의 말초 혈액에서 발견되었다. 1,997 ^2가 혈관 재생 및 수리에 대한 새로운 가설과 전략의 주입을 가져 인치 EPCs은 혈액 순환의 드물지만, 일반적인 구성 요소입니다 그 혈관 형성이나 혈관 리모델링의 사이트에 대한 가정, 그리고 세포 ³ 파생 기존 선박 벽 paracrine 자극을 통해 주로 중 출생 후의 vasculogenesis, angiogenesis, 또는 arteriogenesis을 용이하게합니다. EPC를 식별하기위한 특별한 표지가 식별하지 않으며, 필드의 현재 상태는 proangiogenic 조혈 줄기 및 전구 세포를 포함한 그 많은 세포 유형을 이해하고, angiogenic 세포, Tie2 ⁺ monocytes, 골수양 전구 cel을 순환되었습니다혹시, 종양 관련 macrophages, 그리고 M2 활성화 macrophages는 잠복기 동물 모델 시스템의 다양한 수많은 질병 상태 ^{4, 5의} 인간 과목 angiogenic 과정을 자극에 참여합니다. 내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs) 강력한 clonal proliferative 가능성 replating시 능력을 형성 보조와 차 식민지, 그리고 immunodeficient 생쥐 ^6-8로 이식시 생체내 혈관 형성에서 본질적인 능력을 특징으로 희귀 순환 가능한 내피 세포 수 있습니다. ECFCs이 성공적으로 건강한 성인 과목, 건강한 신생아 유아의 탯줄 혈액 (CB), 그리고 수많은 인간의 동맥과 정맥 혈관 ^6-9의 혈관 벽의 말초 혈액으로부터 격리되어 있지만, CB는 ECFCs ^7의 높은 주파수를 보유하고 그 표시 가장 강력한 clonal proliferative 잠재력과 생체내 ^{8, 10-13의} 형태로 내구성과 기능성 혈관을. 동안의 유도성인 말초 혈액에서 ECFC 여기서 우리가 파생을위한 방법론을 ^{설명하는, 14, 15를} 발표되었으며, 복제, 확장, 그리고 체외에서뿐만 아니라 인간의 탯줄 CB에서 ECFCs의 생체내 특성에 있습니다.

프로토콜

시약 및 솔루션

EMG-2 미디어 (Lonza, 고양이. 번호 CC-3162 EBM-2 기초 미디엄과 EGM-2 SingleQuot 키트 보충, 및 성장 요인을 포함)

EBM-2 (Lonza, 고양이. 번호 CC-3156)는 전체 SingleQuot 키트 보충 및 성장 요인과 보충 (Lonza, 고양이. 번호 CC-4176), 10 % (V / V) 태아 소 혈청 (FBS) 및 1% (V / V) 페니실린 (10,000 U / ml) 쇼핑 / 스트렙토 마이신 (10,000 μg / ml) 쇼핑 / amphotericin (25 μg / ml) 쇼핑. 4 ° C.에서 1 달에 최대 저장 않는 ECFC 문화를 위해 사용하는 것이 좋습니다 EGM-2 볼륨이 500 μl / 잘 24 - 잘 접시를위한 2 개 ML / 음 6 잘 번호판, ^5ml/25-cm이 flasks, 10 ^ml/75-cm이 flasks입니다 달리 프로토콜에 지정.

콜라겐 전 용액

멸균 증류수의 495 ML (0.02 N 최종 농도)에 빙초산 (17.4N)의 0.575 ML을 희석. 0.22-μm의 VAC과 무균 필터 묽은 초산uum 여과 시스템입니다. 50 μg / ML의 최종 농도에 묽은 초산 25 MG의 쥐의 꼬리 콜라겐 I를 추가합니다. 콜라겐의 양은 콜라겐 주식 농도에 따라 다릅니다 덧붙였다. 4 ° C.에서 한달까지 저장

콜라겐 I-코팅 조직 배양 표면의 작성

6 잘 조직 배양 플레이트 (/도 24 잘 번호판, ^3ml/25-cm이 flasks, 8 ^ml/75-cm이 flasks 300 μl를 사용) 각각 우물에 콜라겐 전 솔루션의 장소 1 ML. 37에서 하룻밤에 1 시간을 품어 ° C. 콜라겐 한테 해결책을 제거하고 PBS (6 잘 번호판, ^5ml/25-cm이 flasks, 10 ml/75 위해 μl / 잘 24도 접시 2 개 ML / 음 500을 사용으로 표면에 두 번, 매번 씻어 ^-CM이 flasks). 세포 배양을 위해 즉시 번호판을 사용합니다.

FACS의 염색법 버퍼

식염수 (PBS가) 2 % (V / V) 태아 소 혈청 (FBS)와 함께 보충 인산 버퍼. 스토어 U4에서 2 주 P ° C.

A. ECFC의 파생물, 복제 및 확장

1. 상온에서 실험에 대한 항응고제 및 수송으로 헤파린 (10 U 헤파린 / ML 혈액)이나 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 CB를 수집하고 mononuclear 세포 (MNC) 절연을위한 즉시 (유아 인도 2 시간 이내) 프로세스 샘플을.
2. 나누어지는 15 각 50 ML 원추형 원심 튜브에 CB의 ML과 섞어 CB 및 피펫 여러 번 각각의 튜브에 PBS의 20 ML에 추가합니다. 20 ML 주사기로 15 ML Ficoll-Paque를 작성하고 20G 바늘 또는 혼합 정맥을 첨부합니다. 희석 혈액 튜브 하단의 혼합 정맥의 팁을 놓고 조심스럽게 15 ML Ficoll-Pague을 밑받침. 감속 브레이크 설정없이 상온에서 740 XG에 튜브 30 분 원심 분리기.
3. 트랜스퍼 피펫을 사용하여 Ficoll-Paque와 희석 플라즈마 사이의 인터페이스에 위치 저밀 MNCs의 불투명 레이어를 제거합니다. 50 ML 원뿔 튜브 cont에 MNCs 하는걸10 ML EGM-2 매체를 aining. 높은 감속 브레이크 설정으로 상온에서 515 XG에 MNCs 10 분 원심 분리기.
4. 조심스럽게 기음과 뜨는 버리고. 두번 EGM-2 (515 XG시 10 분)로 pelleted 세포를 씻고 1.25 X 10 ⁷ 셀 / ML에서 EGM-2에 MNCs를 다시 일시 중지합니다. 콜라겐을 준비 한 ML 쥐처럼 꼬리 콜라겐 유형 I (50 μg / ML)를 추가마다 잘하고 하룻밤 번호판을 잠복기에 의해 나는 코팅 6 - 잘 조직 배양 플레이트. 피펫 4 각도에이 MNC 서스펜션의 ML 37에 전지를 배치 ° C에서 5 % CO ₂ 배양기 humidified. A.1.5) 24 시간이 흐른 (1 일), 천천히 피펫으로 우물에서 보낸 매체를 (느슨하게 자기편 세포를 방해하지 않음) 제거 천천히 잘는 4 ML EGM-2를 추가하고, 배양기에 플레이트를 반환 . 일 2 일, 새로 고침 천천히 피펫있는 우물에서 매체 (느슨하게 자기편 세포를 방해하지 않음) 제거 및 4 ML EGM-2 각도에​​ 추가하여 매체. 매체 변경 일일 해제를 반복7 일 모든 다른 그날까지 ECFC의 식민지가 복제에 게재 이후까지. 일반적으로 식민지 하루에 5 일 십사일에게 ⁷ (그림 1) 사이에 나타납니다.
5. 거꾸로 현미경을 사용하여 조약돌 형태로 일반적인 ECFC 식민지를 떠올 (배율 10 배)와 각 식민지의 위치를​​ 나타내기 위해 우물 아래쪽에 마커와 식민지 경계선을 표시합니다.
6. 일 14 일, PBS 및 복제 실린더를 사용하여 수확 개별 식민지로 이러한 기본 식민지에게 2 번 씻고 충분 실린더 내부의 세포를 충당하기 위해 Express를 TrypLE. PBS의 마지막 빨래를 aspirating 후, 각 콜로니 주변 살균 젤 코팅 복제 실린더를 놓고 멸균 집게를 사용하여 플레이트에 대해 단단히 누르십시오. 실린더 내의 세포가 분리 시작할 때까지 3-5 분 각 복제 실린더 및 부화로 따뜻한 TrypLE 급행로부터 2-3 방울을 추가합니다. 실린더의 중앙에 약 250 μl EGM-2 배지를 추가하고 g로와 아래로 피펫단일 세포 현탁액을 enerate. 개별 마이크로 원심 튜브에 각각 복제 실린더에서 단일 세포 현탁액을 전송합니다.
7. 남아있는 모든 세포를 수집하고 각각의 마이크로 원심 튜브에 각 실린더에서 빨래를 전송하는 약 250 μl EGM-2 배지와 함께 실린더 3 배 이내 지역을 씻는다. 5 분 동안 탁상 원심 분리기에서 높은 속도 (≤ 300 XG)에서 세포를 원심 분리기.
8. 1.5 ML 신선한 EGM-2 배지에서 뜨는 제거하고 다시 중단 세포 펠릿. 500 μL 둥둥 꼬리 콜라겐 나 (50 μg / ml) 쇼핑과 미리 코팅된 24-잘 조직 배양 플레이트 잘 하나에 각 관에서 세포 현탁액을 (개인 콜로니의 모든 세포를 포함)의 전송합니다.
9. 매체와 확장을위한 인큐베이터 내부의 장소는 매일 수행 변경합니다.
10. 세포 80-90% confluency 접근할 때, PBS로 세포에게 세차 후 2 번 보냈다 매체를 제거하고 각 잘 500 μl TrypLE 특급 매체를 추가할24 잘 조직 배양 플레이트의. 세포가 주위 분리하기 시작할 때까지 3-5 분 동안 인큐베이터 안에서 접시를 놓습니다. 세척하여 세포를 수집하고 15 ML 관에게 전송하는 각 잘으로 EGM-2 1 ML을 (10 % FBS를 정의 포함)에 추가합니다. 남아있는 모든 세포를 수집하고 각 15 ML 튜브에 각각 우물에서 빨래를 전송하는 하나 ML EGM-2 배지로 잘 씻으십시오. 5 분 300 XG에 세포를 원심 분리기.
11. 한 ML 신선한 EGM-2 배지 (10 % 정의된 FBS 포함)에서 매체를 제거하고 다시 중단 세포 펠릿. hemacytometer와 trypan 파랑 제외를 사용 나누어지는의 가능한 셀의 개수를 구합니다.
12. 세포가 다시 하위 culturing 전에 confluency 80~90% 접근 때까지 미디어가 매일 변화 EGM-2 미디어에서 난 미리 코팅 조직 배양 표면 콜라겐에 5000에 대한 세포 / ㎝ ^2를 퍼뜨리고하여 세포를 확장합니다.

ECFCs의 시험 관내 Phenotypic 특성화에 B. : 내피 세포 표면 항원 표현Clonal Proliferative 잠재위한 D 단세포 분석

1. 내피 세포 표면 항원 발​​현의 경우 ECFC 복제 및 확장에 대해 설명하는 방법을 사용하여 세포를 수집하는 TrypLE 특급으로 세포를 분리.
2. FACS의 염색법 버퍼에서 다시 정지 세포 (10 X 10 ⁶ 세포 / 버퍼를 더럽히는 것 1ml FACS) 다음 FcR 차단 시약 (20 μl / 10 X 10 ⁶ 셀)를 추가 10 분 동안 얼음에 부드럽게과 장소 섞는다.
3. 각 내피 표면 항원 및 isotype 제어를위한 마이크로 원심 튜브에서이 세포 현탁액의 나누어지는 100 μl. 1. X 10 ⁶ 셀 : 내피 항원 (CD31, CD144, CD146과 CD105) 또는 조혈 항원을 (CD45 및 CD14) 인식하고 빛으로부터 보호 30 분 동안 얼음을 켜 놓고 fluorochrome 라벨이 인간 단클론 항체의 적절한 양을주의 사항 추가 각 테스트 필요하지 않습니다. 저자는 일반적으로 10 ^4는 분석이 X를 얻기 위해 0.5-1 X 10 ⁵ 세포 / 튜브를 준비D 이벤트. 또한 각 테스트에 사용되는 항체의 양을 위해 제조 업체의 권장 사항을 따르십시오. 일부 항체는 최적의 항체 농도를 결정하는 titrating 요구할 수 있습니다. 저자가 수행한 모든 염색법은 단일 색상의 염색법입니다.
4. 얼음 부화 후 30 분 후, 5 분 탁상 원심 분리기에 높은 속도로 각각의 튜브를 원심 분리기 그러면 뜨는을 제거하고 FACS 버퍼에 다시 중단 세포 펠릿.
5. 각 항원에 대한 긍정적 또는 부정적 얼룩 세포의 비율을 결정하는 흐름 cytometer에 샘플을 분석. ECFCs는 CD31, CD144, 그리고 CD146에 대해 균일하게 긍정적인 얼룩지만, CD45과 CD14에 대한 부정은 해당 isotype 컨트롤에 비해.
6. clonal proliferative 가능성을 검토하기 위해 단세포 분석 내용 ECFC 복제 및 확장에 대해 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 세포를 수집하는 TrypLE 익스프레스 초기 통로 (2-3) 세포를 분리.
7. 이러한 세포를 감염향상된 녹색 형광 단백질로 (EGFP) lentiviruses ¹⁶ 표현하고 형광 cytometry에 의해 EGFP를 표현하는 세포를 수집주의 :. lentivirus 작업은 생물 학적 위험과 모든 생물 안전 사고 예방 차원에서 순종해야 간주됩니다.
8. 문화 그들은 ECFC 확장을위한 섹션에서 culturing의 ECFC에 대해 설명했다.
9. 50 μl 둥둥 꼬리 콜라겐 유형 I (50 μg / ml) 쇼핑 당도 추가하여 콜라겐 I 코팅 96 - 웰 플레이트를 준비하고 야간에 대한 번호판을 품어. TrypLE Express를 사용하여 EGFP ⁺ ECFCs를 수집하고 최종 농도 ~ 10 ⁶ 세포 / ML로 EGM-2 배지에서 그들을 resuspend.
10. 하나의 EGFP ⁺ ECFC마다 잘 96 - 웰 플레이트의를 정렬하고 EGM-2 회 아니라 200 μl에 최종 볼륨을 조정하기 위해 20 셀 / 초의 낮은 유속으로 FACS 유리한 (Becton 딕슨)이나 다른 비교 슬라이더 정렬을 사용합니다. 각 우물이 하나의 세포를받지 않도록 간접 형광 현미경을 사용합니다. Alternativ엘리는 하나의 세포는 FSC와 SSC와 식민지는 세포 채점 및 부량 사용할 수 있습니다 더럽히는 것 Sytox 핵을 염색을 기준으로 정렬할 수 있습니다.
11. 일 5 일 10 일 공연이 미디어 변경 (200 μl EGM-2를 사용하여 멀티채널 pipetter)와 함께 2 주간에 걸쳐 번호판을 품어. 문화 일 14 일 30 분 4 % paraformaldehyde 100 μl와 세포를 고정하기 전에 100 μl PBS로 각 잘 씻는다. EGFP을 표현하지 않는 ECFCs 들어, 4 ° C에서 하룻밤 사이에 paraformaldehyde 고정 및 품어 따라 Sytox 시약, 녹색 형광 핵 염료를 추가합니다.
12. 14 일 배양해 단세포에서 확대 내피 세포의 수를 quantitate 각 우물을 조사하기 위해 형광 현미경을 사용합니다. 정량 분석​​을 위해, 점수 긍정과 같은 2 개 이상 내피 세포 (확산)와 우물과 형광 현미경으로 시각적으로 계산하여 총 내피 세포 개수에 대해 더 그들을 검사합니다.
13. T를 표시하려면2로 50, 51-2000, 2001 또는 그 이상으로 간주됩니다 : 그 중 내피 세포 번호와 데이터, 우물을 얻은 내피 세포 클러스터, 낮은 proliferative 가능성 (LPP) ECFCs, 높은 proliferative 가능성 (HPP) - 각각 ECFCs. ECFCs 14 일 동안 단일 세포 수준에서 배양해 때 내피 클러스터, LPPs 및 HPPs에게 상승을주는 clonal proliferative 가능성을 완전히 계층을 전시 ^7.

생체내 혈관 형성 분석에서는 Vasculogenesis 대한 ECFC의 가능성을 검사하기 : ECFCs의 생체내 기능 특성화에서 C.

1. FBS (10 : 1-ML 젤 (이 나중에이 이식을 생성하는 bisected됩니다) 주조하는 데 필요한 다음과 같은 겔 재료의 각각의 총 부피 (ML)을 (괄호 안에 최종 농도) 계산하여 cellularized 겔 이식 준비 %), EBM-2 10시 1분 (1 ML에 최종 볼륨을 조정), 나트륨 중탄산염 (1.5 밀리그램 / ML), NaOH (7.4로 산도를 조정), HEPES (25 ㎜), fibronectiN (100 μg / ml) 쇼핑 및 콜라겐 전 (1.5 밀리그램 / ML).
2. 겔 재료 계산 후 ECFC 복제 및 확장에 대해 설명한 것과 유사한 방법을 사용하여 세포를 수집하는 TrypLE 특급으로 세포를 분리. hemacytometer와 trypan 파랑을 사용 나누어지는의 가능한 셀 개수를 구합니다. 50 ML-원뿔 튜브 및 펠릿 515 XG, 실온에서 원심 분리하여 세포에 2,400,000 실행 가능한 세포를 전송합니다. 동시에 얼음처럼 차가운 50-ML 원뿔 튜브 (그들이 나와있는 것과 같은 순서로)로 계산 HEPES의 볼륨, 나트륨 중탄산염, EBM-2 10시 1분, FBS, fibronectin과 콜라겐을 추가하여 겔 매트릭스 솔루션을 준비합니다. 철저하게 섞어서 얼음 솔루션을 유지하면서 NaOH와 7.4로 산도를 조정합니다.
3. 원심 분리 후 세포의 표면에 뜨는을 무시하고 360 μl 따뜻한 EGM-2의 펠렛을 다시 중단하고 여기에 산도 겔 보형물 한 ML의 최종 볼륨을 만드는 겔 매트릭스 솔루션의 840 μl를 조정 마세요. 때까지 천천히 겔 매트릭스 용액으로 세포를 섞어세포는 철저 겔 용액에 중지됩니다.
4. 12 잘 조직 배양 플레이트와 20-30 분 품어 겔은 polymerizes까지 잘 하나에게 한 ML cellularized 겔 현탁액을 전송합니다. 부드럽게 두 ML 따뜻한 EGM-2로 젤을 덮어 하룻밤 알을 품다.
5. 즉시 이식하기 전에 홍채 가위를 사용하여 두 동등한 조각으로 하룻밤 incubated 젤 이등분 잘 EGM-2 배지가 들어있는 동일한 문화 겔 조각을 반환합니다.
6. isoflurane 마취를 관리할하여 (5~6주 오래된 NOD / SCID 마우스) 진정 동물에게 동물의 수술 시설을 사용하십시오. 복부의 아래 부분을 면도하고 철저 알코올 패드와 betadine이나 다른 소독제와 외과 사이트를 청소하십시오. 그런 다음 IACUC 및 제도적 지침에 따라 커튼과 함께 지역을 격리.
7. 피부와 복근 사이에 피하 공간을 노출, 복부의 아래쪽 사분면에 약 5 밀리미터 절개를 만들기 위해 멸균 선명한 홍채 가위를 사용하여. 상단 복부 사분면으로 우수한 선도 15~20mm 넓은 주머니를 만드는 복부 근육의 피부 계층을 통해 야기한 절개를 수행합니다. 같은 마우스 복부의 또 다른 측면에서 유사한 오픈 포켓을 만들어 유사한 절차를 반복합니다.
8. 절개에 바로 꼬리 피부 레이어를 리프팅하여 복부 주머니의 또 다른 측면으로 절반의 복부 주머니 한쪽에 젤의 조각과 겔 다른 반을 떼어 넣습니다.
9. 젤 삽입 후 절단 바늘에 5-0 폴리 프로필렌의 봉합사를 사용하여 2-3 바늘과 각 절개를 닫습니다. 적절 케이지 카드 라벨과 기관 및 프로토콜 요구 사항에 따라 사후 수술 모니터링 및 진통제를 수행하고 이러한 이식 젤의 세포 14 일 드 노보 vasculature를 생성할 수 있습니다.
10. 마지막으로, 겔 보형물의 수확하는 것은 일반적으로 마우스를 euthanizing부터 14 일 주입 후에 수행됩니다.
11. 면봉 복부 알코올 패드 공간과원래 절개 라인 꼬리 복부 피부를 잘라. 조심스럽게, 겔의 가능성이 위치에 피부 꼬리의 플랩을 절개하여 보형물을 해부. 다음 겔 주위 circumferentially 아연 정착액의 장소 (BD Biosciences, 최적의 결과에 대한 제조 업체의 권장 사항을 따르십시오)를 절단시키고 실온에서 1~2시간 동안 고칠 수 있도록하여 소비세 이식.
12. 표준 histochemical 프로토콜을 사용하는 파라핀 - 임베디드 젤류을 준비하고 hematoxylin과 eosin, 겔 내에서 vasculature을 시각화하기 위해 안티 - 인간 CD31 또는 안티 마우스 CD31과 염색법을 수행하기 위해 유리 슬라이드 5 μm의 섹션을 준비합니다. ECFCs은 인간화 혈관을 생성하는 데 노보 vasculogenesis을 받다 cellularized에서 젤 임플란트 14 일 ^4,8,11 동안 immunodeficient 생쥐에 삽입.

D. 주재원 결과

기본 식민지 양식의이 ECFC 파생 기법을 사용 우리가 나쁜 자들이 밖으로 성장5 일째 (그림 1)과 같은 초기와 같은 ation. 밖에서 성장 ECFC의 식민지는 전형적인 조약돌 모양을 전시하고 복제에 의한 식민지 픽업 후 장기적인 확장시> 40 인구 doublings로 상승했다. 확장된 식민지는 내피 항원을 표현하지만, (그림 2) 조혈 항원을 표현하지 않았다. 중요한 건, 그들은 단일 세포 수준 (그림 3)에서 clonal proliferative 가능성의 전체 계층 구조를 표시합니다. 또한, ECFCs는 immunodeficient 마우스 ^{4, 6, 8, 11} (그림 4)에 이식했을 때 호스트 RBCs와 perfused되는 인간화 혈관을 형성했다.

1 그림. 내피 식민지의 코드 혈액과 파생물에서 mononuclear 세포의 절연 (MNCs)는 코드 혈액 세포를 Ficoll-Pague 밀도 기울기 분리시 교양 MNCs. MNCs 양식 버피 코트 층의 세포는 (ECFCs)를 형성. 둥둥 꼬리 콜라겐의 문화 MNCs에 버피 코트 층의 절연 나는 5~14일의 ECFC 식민지의 파생물에 코팅된 플레이트 결과입니다. 파생물의 ECFC 식민지는 (화살표 머리로 표시) 조약돌 형태 ⁷ 표시됩니다.

그림 2. 내피와 조혈 세포 표면 항원 표현의 체외에서 대표 phenotypic 평가. Immunophenotyping 탯줄 혈액 파생 ECFCs 중 ECFCs는 내피 항원 CD31, CD34, CD144, CD146, 편명-1, Flk-1, 편명-4 및 Nrp2을 표명했지만 것으로 나타났다 조혈 항원 CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 또는 AC133 ^{7, 8을} 표현하지 않았다.

그림 3. clonogenic 및 CB 파생된 ECFCs의 proliferative 가능성의 시험 관내 quantitation의 대표. () 코드 혈액- 파생 ECFCs 정보> 2001 년 식민지까지 2-50 세포 클러스터에서부터 식민지의 계층과 clonal proliferative 가능성을 표시합니다. (B) 식민지 (식민지 Sytox, 더 나은 품질의 사진을 찍을 수있는 녹색 형광 핵 염색, 물들일)의 계층 구조의 Micrographs은 후에 얻은 탯줄 혈액 유래 ECFCs 14 일 동안 단일 세포 수준에서 배양해되었다. 스케일 바는 100μm ^{7, 8을 나타냅니다.}

4 그림. 코드 혈액 파생 ECFCs의 생체내 기능적인 특성의 대표. 코드의) H & E 염색법 혈액 파생 cellularized 겔 이식을 포함 ECFC은 microvessel (호스트 RBCs 가득) 이식 14 일 후 콜라겐-fibronectin 젤의 형성을 지적했다. B) 반 (反) 인간 CD31의 염색법 (갈색 염색법)은 더 이상 이러한 혈관의 인간의 기원을 확인.

토론

putative 내피 전구 세포의 Phenotypic 및 기능적 특성은 clonally하고 순차적으로 다시 도금 문화에 능력이있다 타고난 ECFCs를 파악하고 생체내의 내구성과 기능성 implantable 혈관을 야기할 것이 중요합니다. 인간의 탯줄 혈액은 ECFCs 및 노화 또는 질병 ¹⁰ 이러한 순환 세포 감소의 농도로 풍부합니다. 최근 연구 ECFC은 혈관 상해, 심근 경색, 또는 망막 병증 ^17-19의 상황에서 혈?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
헤파린 나트륨 주입, USP	APP 제약	504,031
Ficoll-Pague	Amersham Biosciences	17-1440-03
혼합 정맥	Maersk 의료	500.11.012
EGM-2	Lonza	CC-3162
정의 FBS	Hyclone	SH30070.03
TrypLE 급행	Gibco	12,605
쥐 종류 나 콜라겐	BD Biosciences	354,236
Matrigel	BD Biosciences	356,234
FcR 블록	Miltenyi 생명 공학	130-059-901
hCD31, FITC conjuga널어서 말리다	BD Pharmingen	555,445
hCD45, FITC 복합	BD Pharmingen	555,482
복합 hCD14, FITC	BD Pharmingen	555,397
hCD144, PE 복합	eBioscience	12-1449-80
hCD146, PE 복합	BD Pharmingen	550,315
hCD105, PE 복합	Invitrogen	MHCD10504
MS IgG 1, K 항체, 복합 FITC	BD Pharmingen	555,748
MS IgG 1, K 항체, 복합 체육	BD Pharmingen	559,320
MS IgG 2A, K 항체, 복합 FITC	BD Pharmingen	555,573
안티 인간 CD31	Dako	클론 JC70 /
안티 mous전자 CD31	BD Pharmingen	553,370
0.22-μm의 진공 여과 시스템	Millipore	SCGPU05RE
빙초산, 17.4N	어부	A38-500
항생제 - Antimycotic	Invitrogen	15240-062
태아 소 혈청 (FBS)	Hyclone	SH30070.03
IHC 아연 정착액	BD Biosciences	550,523
Sytox 녹색 시약	Invitrogen	S33025
멸균 복제 실린더,	피셔 과학	07-907-10