הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

Summary

העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות של א coli מארז ¹. דרכים קלות כדי לחזות ולכמת דבקות מוסברות.

Abstract

השיטה המתוארת כאן מורכבת בעיצוב מחדש של ה תכונות היצמדות coli על ידי הרכבת המספר המינימאלי של גני curli תחת השליטה של אמרגן חזק והמתכת overinducible, ובהדמית וכימות הרווח כתוצאה של דבקות בקטריאלי. שיטה זו חלה עקרונות הנדסיים מתאימים של הפשטה ותקינה של ביולוגיה סינטתית, ותוצאות בBBa_K540000 Biobrick (המכשיר הכי חדש Biobrick, הנדסה, iGEM 2011).

הצעד הראשון מורכב בעיצוב של אופרון הסינטטי מוקדש לייצור יתר curli בתגובה למתכת, ולכן בהגדלת יכולות ההיצמדות של הזן הפראי הסוג. המקורי curli אופרון שונה בסיליקון ועל מנת לייעל את אותות תעתיק וtranslational ולברוח רגולציה "הטבעית" של curli. גישה זו אפשרה לבדיקה בהצלחת ההבנה הנוכחית שלנו של ייצור curli. Moreover, לפשט את רגולצית curli ידי מעבר האמרגן המורכב אנדוגני (יותר מ 10 רגולטורי תעתיק מזוהה) לאמרגן פשוט מתכת מוסדרת גורם דבקות הרבה יותר קלה לשלוט.

השלב השני כולל הערכה איכותית וכמותית של יכולות דבקות על ידי יישום של שיטות פשוטות. שיטות אלו חלות על מגוון רחב של חיידקים חסידים ללא קשר למבנים ביולוגיים המעורבים בהיווצרות biofilm. מבחן דבקות בצלחות קלקר 24 גם מספק הדמיה ראשונית מהירה של biofilm החיידקים לאחר צביעה סגולה גביש. מבחן איכותי זה יכול להיות מחודד על ידי הכימות של אחוז הדבקות. שיטה כזאת היא מאוד פשוטה אך מדויקת יותר מכתים סגולה גביש רק כפי שתואר לעיל ¹ עם שתי דירות ושחזור טובים. ויזואליזציה של חיידקי ה-GFP-tagged על שקופיות זכוכית על ידי קרינה או conf הליזרמיקרוסקופיה ocal מאפשרת לחזק את התוצאות שהתקבלו במבחן הצלחת 24 היטב על ידי תצפית ישירה של התופעה.

Introduction

היצמדות חיידקים לתמיכת אביוטי ממלא תפקיד מרכזי בתאי דלק bioremediation, biocatalysis או חיידקים. תהליכי bioremediation להשתמש ביכולות של מיקרואורגניזמים לבזות חומרים אורגניים, או כדי לשנות את חלוקת המתכת (קיבוע, volatilization) או התפצלות. פעילויות מועילות אלו שנצפו במערכות אקולוגיות ימיות ויבשתיות, אלא גם במערכות המלאכותיות שפותחו לטיפול במים מזוהמים בפסולת תעשייתית וביתית. העצמה והאיכות של פעילות החיידקים תלויים בגורמים הפיסיקליים כימיים, אלא גם על אורח החיים של מיקרואורגניזמים (חסר בסיס או מוטבע לתוך biofilm). היווצרות biofilm קשורה חילוף חומרי קידום התנגדות לביוצידים ידי מנגנונים מגוונים. תופעה זו לכן יש לעודד ברוב תהליכי bioremediation. יתר על כן, תאי coli Escherichia הנדסה לשלוט על היווצרות biofilm כבר מיושמים בהצלחהחיישנים לשתק כל התאים בbiochips ^2-3.

הסתגלות של מיקרואורגניזמים לריכוז גבוה של מתכות מתרחשת באמצעות מנגנונים מגוונים כגון ספיחה למרכיבים תאיים מטריקס, הפעלת משאבת זרימה או לספקים מסוגלים להתרכז המתכת לתוך התא. גברת פעילות חיידקים אלה באמצעות הנדסה גנטית מאפשרת טיפול יעיל וזול של זיהום מתכות בקנה מידת המעבדה, במיוחד במקרה של מתכות רעילות ביותר בכמות חלשה כפי שתואר על ידי הראגו et al. 2008 ^4. תיקון חיידקים מייצג במקרה זה שיטת חיסכון תחרותית ועלות בהשוואה לתהליכים כימיים קלסיים באמצעות רפי חילוף יונים. החוקרים תארו א מארז coli מהונדס גנטי לספיגה ואצירה 1 קובלט יפרוץ את זרימת משאבת הקידוד הגנטי rcnA, ולאחר מכן על ידי שינוי עם עותק רב המאפשרים ייצור יתר של פלסמידטרנספורטר עם ספיגה מועדפת לקובלט. כזה מתח מופיע כחלופה יעילה לרפי חילוף יונים לטיפול בשפכים רדיואקטיביים, אך בעיה לא נפתרה מפתח היא ההתאוששות של חיידקים מזוהמים בסופו של התהליך ^4. המטרה של העבודה שלנו הייתה אפוא מהנדסת זן מותאם אישית מעוצב תוכל להיצמד לתומך אביוטי כגון זכוכית או פלסטיק.

בין המערך השלם של adhesins ונמצא מולת חסיד זיהתה בחיידקי גראם, בחרו לעצב מערכת המאפשרת ייצור curli. Curli הם סיבי עמילואיד דקים (2-5 קוטר ננומטר) ומדדים המאוד שבולט מE. חיידק סלמונלה ופני שטח כמטריצת גבישים שאינם מסיסה ^ו5-7. Curli מעורב גם בקולוניזציה של משטחי אביוטי והפיתוח של biofilms ^8. Curli הוצגו לאחרונה לאגד כספיים יונים ^9. Amyloids ידוע אכן להחזיק גבוהזיקה ליוני מתכות כגון Cu ^{2 +,} Zn ^{2 +} ו ^{3 + 10} פה. מאפיין זה עשוי לשפר עוד יותר את הטיהור של שפכים מזוהמים מתכת. אשכול CSG אחראי לייצור של סיבי curli והוא מכונן בשתי operons divergently תעתיקים (איור 1). CsgB, גני csgC csgA ומהווים אופרון התחושה, קידוד שתי יחידות curli, CsgA וCsgB. CsgC נראה שמעורב בפעילות חיזור בתוך מערכת biogenesis curli ולהשפיע על התנהגות CsgG נקבובית ^11. עם זאת, היעדר csgC ברוב המכריע של חיידקי curli לייצור מצביע על כך שהחלבון המקביל מספק רק רמת secundary שליטת biogenesis curli. כדי לפשט את המערכת, אנחנו כבר בחרנו לעבוד עם המספר המינימאלי של גנים.

CsgDEFG operonencodes חלבונים חיוניים בוויסות והתחבורהשל CsgA וCsgB על פני התא. CsgD הוא activator תעתיק של אופרון csgBAC וממלא תפקיד מרכזי בשליטה על היווצרות biofilm על ידי שליטה על הייצור של רכיבים ונמצא מולת curli biofilm אחרים כגון ¹² תאיים ועל ידי דיכוי ייצור השוטון ^13. CsgE, CsgF וCsgG מהווים מנגנון הפרשה curli ספציפי ב- הקרום החיצוני שדרכו החלבון העיקרי CsgA מקטע curli מופרש כחלבון מסיס. פילמור של CsgA תלוי in vivo על nucleator חלבון CsgB קרום הנכנס (שנסקר ^ב14). מסלולים רגולטוריים שונים הכוללים מספר מערכות שני מרכיבים הוכחו לשלוט ביטוי curli גן ^15-16. תקנות מורכבות אלה מאפשרות לחיידקי טופס biofilms העבה באמצעות ייצור curli בתגובה לאותות סביבתיים, אך קשים לשלוט עבור יישומים תעשייתיים. כדי להקל על ההתאוששות נפגשהאל ממולא חיידקים בתהליך תעשייתי, קיבוע חיידקים לתמיכה מוצקה אכן צריך להיות מבוקר על ידי פרמטר מוגדר היטב (הים). המאפיינים החסידים של curli צמודים ^ל17 טבע עמילואיד ויכולים לשמש כדי לשפר את תהליכי bioremediation, אבל מכשיר פשוט ובקלות מבוקר יש ליצור.

בין 7 גנים ¹⁸ אלה, קבוצה של 5 גנים נדרשת לcurli סינתזה (csgB ומונומרים סיבי קידוד csgA) ויצוא (csgE csgF וcsgG, קידוד מורכב הפרשת curli) בהחלט נבחרו לבנות אופרון הסינטטי. כדי להימלט מהרגולציה "הטבעית" של curli, אופרון סינטטי הכולל 5 גני CSG אלה תחת השליטה של אמרגן חזק וoverinducible קובלט (איור 2) תוכנן ומסונתז. ניתוח שלב אחר השלב באזור curli הקידוד ועיצוב ההליך לsyn פונקציונליהאוהד אופרון מתואר. שתי שיטות כדי לחזות ולכמת היצמדות חיידקים לקלקר וזכוכית מוסברות.

Protocol

1. עיצוב וסינתזה של Biobrick Curli אופרון

1. לקבוע את הארגון הגנטי ולמקם את אותות התעתיק וtranslational אנדוגני של גני curli. ידיעות אלו נאספים במאגרי מידע מיוחדים כגון RegulonDB או EcoGene ^ב והשלימו על ידי קריאה מדוקדקת של פרסומים הנוגעים לעניין. ניהול נתונים ובpreanalysis סיליקו בוצע עם תוכנת מנהל המשובטים ^ג.
2. בחר את רצפי קידוד הרלוונטיים. סט של חמישה גנים דרושים לחלוטין לcurli סינתזה (csgB ומונומרים סיבי קידוד csgA) ויצוא (csgE csgF וcsgG, קידוד מורכב ההפרשה התעגלה) נבחרו לבנות אופרון הסינטטי. חלץ את הרצפים שנבחרו ממאגר המידע בפורמט FASTA.
   כצביר csgGFE הוא antisense בE. גנום חיידק, להמיר את הרצף הזה לcounterp המשלים ההפוךאמנות באמצעות כלי תפעול המנהל המשובט> מולקולת תהליך> הפוך מולקולה. הדבק את רצף csgEFG מאחורי csgBA באמצעות הפונקציה "לקשור" (Clone> לקשור).
3. הוסף האמרגן המתאים. על ידי צבת חמישה גני curli הנבחרים תחת שליטה של אמרגן P RCN, curli הם חזו להיות מיוצר מעל בנוכחותו של קובלט וניקל. RCN הלוקוס מקודד משאבה אחראית לסילוק הרעלים וניקל Co (rcnA) ורגולטור metallo מאותו המקור שלה (rcnR) זרימה. RcnR שולט ביטוי של rcnA וגן משלו בתגובה לניקל ולשיתוף ^19. רצף RCN כולל CDS rcnR, כל אזור intergenic RCN בתוספת 41 נוקלאוטידים הראשונים של rcnA היה מול placedin של הרצף המתעתע csgBAEFG (1 איור, הרצף של כל המבנה מסופק כנתונים משלימים).
4. לייעל את התעתיקאותות. אתר קישור הריבוזום מושלם (או RBS המושלם = AAGGAGGTATATA) נוסף בחזית ATG הראשון של רצף ה-DNA csgBA. RBS מושלם שני נוסף לפני רצף csgEFG. RBS אנדוגני לcsgB וגני csgF וcsgG היו נשמר.
5. כדי להתאים סטנדרטי iGEM, המכשיר חייב להיות מוקף בקידומת BioBrick סטנדרטית וסיומת, המכיל אתרי הגבלה לRI אקו, PST I (קידומת) וSPE אני וXba (סיומת). הדבק את הרצפים המתאימים בכל קצה של ^ד המכשיר.
6. לחסל כל RI אקו, PST, אני SPE ואתר ההכרה Xba במכשיר. כדי להקל על תהליך הרכבה נוסף, חלק BioBrick עצמו לא יכול להכיל כל ההגבלה של אתרים אלה. בניתוח הגבלת סיליקו של המכשיר מתגלה 1 Pst אני אתר ברצף csgA, אתר ש1 Pst ברצף rcnRואתר אחד Eco RI בגן csgE. אתרים אלה ממוקמים בהתאמה בעמדה 80 (Mut1), 1340 (Mut2) ו -1830 (Mut3) של רצף ההתקנים (נתונים משלימים) ושונו כפי בצע על ידי מוטציות שקטות.
   אתר Mut1 Pst אני CTGCAG השתנה בCGTCTG
   אתר Mut2 Pst אני CTGCAG השתנה בCAGCAG
   GAATTC Mut3 Eco RI האתר השתנה בGAATT
7. הפעלה באמצעות סימולצית התרגום באמצעות תוכנת Clone Manager (המבצע> מולקולות תהליך> מולקולות תרגמו). השתמש יפציץ תכנית יישור הרצף כדי לוודא הומולוגיה המושלמת בין החלבון פרא סוג curli והחלבונים המקודדים על ידי אופרון הסינטטי.
8. הזמן את אופרון הסינטטי. שירותי סינתזת גנים מסחריים זמינים מחברות רבות ברחבי העולם, השותף שלנו היה Genecust (לוקסמבורג). 4 מיקרוגרם של אופרון המלאכותי (3165 נ"ב) התקבל כעבור כמה שבועות ונוספים לpUC57 (pIG2).

2. המחש ולכמת חיידקי חסיד על פוליסטירן

1. ממלא כל היטב של צלחת קלקר 24 היטב עם 2 מ"ל של מדיום מינימאלי M63 (0.2% גלוקוז) ולחסן כל באר עם 106 תאים של תרבות לילה. חיידקים לגדול ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעה 18-48 בלי לרעוד. כל עמודה (4 בארות) מייצגת אופנות. הוסף את הכמות הנכונה של קובלט (לפני 25 עד 100 מ"מימ) ואנטיביוטיקה (אמפיצילין 100 μg.L ^-1) בעת צורך. את 3 השורות הראשונות של הצלחת 24 גם משמשות כדי לכמת את החיידקים חסידים על ידי חישוב ממוצע 3 חזרות, משמאל השורה האחרון משמש כדי להמחיש את biofilm.
2. עבור 3 השורות הראשונות של הצלחת 24 היטב: לכל באר, לשחזר את supernatant המכיל את תאי פלנקטון.
3. זהירות לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של M63 וברכה לשטוף 1 מ"ל עם supernatant הראשוני שהתקבל ב2.2). ברכה זו מכונית תאים שחייה (= S).
4. שחזר biofilm במיליליטר o 1ו M63 על ידי הגירוד וpipetting למעלה ולמטה (= B). מערבולת 15 שניות. להעריך את מספר החיידקים מצורפים משטח ושחייה מהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) לתת את אחוז ההיענות המתאים לכל ערוץ.
5. אחוז ההיענות מחושב על ידי שימוש בנוסחא: Bx100 / (3xS + B).
6. רק לשורה האחרונה של הצלחת 24 היטב: למחוק תאי פלנקטון.
7. לשטוף עם 1 מ"ל של M63 biofilm שהתפתח בתחתית הצלחת.
8. ייבש את הצלחת הפתוחה לשעה 1 ב 80 ° C.
9. הוסף 100 μl של 20% סגולים גביש עבור 2 דקות בכל אחד ואחרי כן על ידי שטיפות ענפות עם מים כדי להמחיש את חיידקי קרקע מצורפות.
   שלושה מבחנים עצמאיים (צלחות) יש לבצע כדי להבטיח שחזור.

3. דמיינו חיידקים חסידים על ידי זכוכית מיקרוסקופית

1. קבל מארז ניאון. ה זן ^דואר coli SCC1 שconstitutively מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ללא הבדל נצפה מזן ההורה MG1655 ²⁰ הוא מארח מתאים לנושא פלסמיד הסינטטי curli אופרון.
2. להפוך SCC1 עם pIG2 פלסמיד (= הסינטטי curli אופרון מוכנס בRI אקו / Pst אני אתר של pUC57 פלסמיד) כדי להשיג את מתח S23. להפוך SCC1 עם שליטת פלסמיד (pUC18) כדי להשיג את לחץ שליטת S24 ^21.
3. לגדול precultures הלילה של S23 ושל השליטה (S24) בזני 30 ° C בM63 בינוני בתוספת סוכר (0.2%) ואמפיצילין (100 μg.L ^-1).
4. לחסן 15 מ"ל של אותו המדיום בצלחות פטרי עם 100 μl של precultures. הוסף את הריכוז המתאים של קובלט (25 מיקרומטר כלומר) ואל תשכח את השליטה השלילית ללא קובלט. להציג את coverslip זכוכית מלבנית 3 בכל צלחת פטרי. דגירת הלילה בשעת 30 ° C בלי לרעוד.
5. הסר את coverslip הלוך ושובמ 'צלחת הפטר ולנקז אותו בזהירות. זהירות לנקות את פניו הנמוכות יותר עם דברים קטנים כותנה ספוגות אתנול ° 70 על ידי ניגוב כל שאריות חיידקים. לתצפית confocal, לנקות את שני קצוות העליונים בכמה מילימטרים כדי לאפשר קיבוע נוסף של coverslip.
6. חיידקי חסיד ניתן דמיינו ישירות אלא במהירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אבל בזהירות למנוע ייבוש של המדגם.
7. לתצפית confocal, להפקיד את coverslip בשקופית זכוכית עם הפנים העליונים מכוסים על ידי biofilm להציב את הפנים. אז biofilm מכוסה coverslip גדול יותר, שהוא קבוע לשקופית הזכוכית בלכה. הפוך את ההתקנה כך שbiofilm עכשיו יהיה בחלק התחתונה של פן.
8. הנח את ההתקנה מתחת למיקרוסקופ הליזר confocal. Axioplan2 LSM510 מיקרוסקופ ליזר ימין (Zeiss) confocal שמש באותה הפלטפורמה ^F Platim.
9. הגדרה. GFP Excite ב488 ננומטר, ולאסוף את קרינת החיידקים בטווח 500-600 ננומטר . השתמש מטרת טבילת שמן 40X לרכישת תמונות בסריקת ליזר מצב confocal. סרוק את המבנים הכוללים תלת הממדיים של biofilms ממשטח המוצק לממשק עם מדיום הגידול, תוך שימוש בשלב של 1 מיקרומטר.
10. ביצוע תחזיות תלת ממדיות עם Imaris תוכנה (Bitplane, ציריך, שוויץ). לקבוע את עובי biofilm על ידי הניתוח של ערך z הממוצע לאורך חלקים אורכיים סטטיסטיים. כימות של biovolumes biofilm ניתן לחלץ מן confocal Z-ערימות כמתוארות במקום אחר ^22.

RegulonDB מספק מידע על ארגון המכניסטי אופרון ופירוקם ליחידות שעתוק, יזמים וסוג סיגמא, גנים והאתרים המחייבים הריבוזום, מחסלים, אתרים מחייבים של רגולטורי תעתיק ספציפיים, כמו גם הארגון שלהם לביטויים רגולטוריים.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

^ב מסד נתוני EcoGene מכיל מידע עדכן אודות ה coli K-12 ורצפי הגנום Proteome, כולל ביבליוגרפיות גנים נרחבות. מוקד EcoGene גדול כבר ההערכה מחדש של אתרי התחלת תרגום. Http://ecogene.org/

^ג http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

^ד http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

מתנת ^דואר של צ'ון צ'או Sze, נאן יאנג אוניברסיטה הטכנית, סינגפור.

^ו Platim המיקרוסקופי פלטפורמה UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

תוצאות

בביאור סיליקו של רצף CSG הסוג הפראי של א ' coli K12 קשור עם אופטימיזציה של אותות תעתיק וtranslational אפשר לעצב היחיד הסינטטי curli אופרון P RCN-CSG מוצג באיור 3 (רצף מלא בנתונים משלימים). פרוטוקול 2 ו 3 פרוטוקול שמשו כדי להמחיש ולכמת דבקות ייצור הקשורים לcurli...

Discussion

שלבים קריטיים

השלב הקריטי ביותר בגישת הביולוגיה הסינטתית הזה הוא עיצוב הגן. עיצוב גן סינטטי יש להקפיד על מנת להבטיח ייצור מערכת יעילה. שני גנים המקודדים את מונומרים סיבים ושלושה גני מקודדי חלבונים מעורבים במערכת ההפרשה שלהם כבר ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
pIG2			pUC57 (pMB1 אורים, 2710 נ"ב) עם בר 3165 נ"ב EcoRI / PstI המכיל P RCN הסינטטי - csgBAEFG אופרון; Amp r
pUC18			Multicopy פלסמיד (pMB1 אורים, 2686 נ"ב), המגבר r
S23			SSC1 (= GFP מתויג-MG1655, מתנת CC Sze) / pIG2
S24			SSC1/pUC18
CoCl 2	סיגמא		מניית פתרון 0,1 M נשמר בטמפרטורת חדר
M63			29
צלחת 24 היטב	Nunc	55429	צלחות קלקר 24 גם