Bacterial Detection & identification au moyen de capteurs électrochimiques

Résumé

Nous décrirons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour la détection rapide de bactéries et d'identification. L'essai comporte une matrice de capteurs fonctionnalisé avec de l'ADN d'oligonucléotides sondes de capture pour des séquences spécifiques d'espèces d'ARN ribosomique (ARNr). Sandwich hybridation de l'ARNr cible avec la sonde de capture et une sonde de détection d'oligonucléotides d'ADN lié à la peroxydase de raifort produit un courant ampérométrique mesurable.

Résumé

Les capteurs électrochimiques sont largement utilisés pour la mesure rapide et précise de glucose dans le sang et peuvent être adaptés à la détection d'une large variété d'analytes. Les capteurs électrochimiques fonctionnent par transduction d'un événement de reconnaissance biologique en un signal électrique utile. La transduction de signal se produit par couplage de l'activité d'une enzyme d'oxydo-réduction pour une électrode ampérométrique. spécificité du capteur est soit une caractéristique inhérente de l'enzyme, la glucose-oxydase dans le cas d'un capteur de glucose, ou un produit de couplage entre l'enzyme et un anticorps ou une sonde.

Ici, nous décrivons une méthode de dosage du capteur électrochimique pour détecter directement et identifier les bactéries. Dans tous les cas, les sondes décrites ici sont des oligonucléotides d'ADN. Cette méthode est basée sur hybridation sandwich de capture et de détection des sondes avec cible ARN ribosomal (ARNr). La sonde de capture est fixée à la surface du capteur, tandis que la sonde de détection est lié à horseradish peroxydase (HRP). Quand un substrat tel que le 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) est ajouté à une électrode avec des complexes de capture-cible-détecteur lié à sa surface, le substrat est oxydée par le HRP et réduit par l'électrode de travail. Cette redox cycle conduit à la navette d'électrons par le substrat de l'électrode à la HRP, produisant le flux de courant dans l'électrode.

Introduction

Utiliser ARNr comme une molécule cible pour la détection et l'identification bactérienne a un certain nombre d'avantages. L'abondance de l'ARNr dans les cellules bactériennes prévoit une limite de sensibilité aussi bas que 250 bactéries par millilitre, sans la nécessité d'amplification de la cible ^1. ARNr bactérien contient des séquences spécifiques d'espèces uniques qui sont accessibles à l'hybridation avec des sondes d'ADN. En conséquence, un ensemble de capteurs électrochimiques peut être utilisée pour identifier des bactéries inconnues, où chaque capteur est fonctionnalisé avec une sonde de capture spécifique d'espèce différente. Capteurs de contrôle positifs doivent être inclus pour une cible d'oligonucléotides synthétiques qui «ponts» de la capture et des sondes de détection pour créer un signal de calibrage interne.

Les capteurs électrochimiques ont une large gamme d'applications de recherche fondamentale et translationnelle. Par exemple, le dosage décrit ici a été utilisé pour mesurer précisément l'effet de E. phase de croissance coli sur les RRNA et le nombre de copies pré-ARNr, qui est d'un grand intérêt pour les chercheurs qui s'intéressent à la physiologie bactérienne ^2. La sensibilité du test de détection électrochimique est déterminé par le rapport signal sur bruit. Une variété d'amplification du signal et des méthodes de réduction du bruit ont été explorées. Nous constatons que l'amélioration de la chimie de la surface du capteur est essentielle pour réduire la liaison non spécifique de la sonde de détection et / ou enzyme HRP. En particulier, une monocouche mixte de alkanedithiols et mercaptohexanol a été trouvée pour réduire le fond, en recouvrant la surface de l'électrode plus complètement, tout en conservant l'accessibilité de la sonde de capture pour l'hybridation de la cible ^3. Ces traitements chimiques de surface sont particulièrement importants pour les essais portant sur des échantillons biologiques complexes.

Protocole

1. Fonctionnalisation des capteurs électrochimiques

1. Préparer la sonde de capture thiolée à une concentration de 0,05 um à 300 um 1,6-Hexanedithiol (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM EDTA et incuber dans l'obscurité à la température ambiante pendant 10 min . L'incubation de la sonde de capture thiolé avec HDT assure que le groupe thiol sur la sonde de capture est réduite, ce qui entraîne des résultats plus cohérents.
2. Appliquer un courant d'azote à l'or nu 16 puce de réseau de capteurs (s) pendant 5 secondes pour éliminer l'humidité et / ou de particules.
3. Appliquer 6 pl du mélange de sondes de capture HDT-thiolé à l'électrode de travail de l'ensemble 16 des capteurs du réseau de capteurs et de stocker la puce de capteur (s) dans une boîte de Petri couverte à 4 ° C pendant une nuit. Des sondes de capture thiolées se lient directement à l'électrode d'or à nu et la HDT agit pour empêcher suremballage des sondes de capture et de les maintenir dans une conformation étendue qui favorise l'hybridation avec la cible.
4. Leaprès jour, laver la puce du capteur avec déminéralisée H ₂ O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
5. Appliquer 6 pi de 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 6-mercapto-1-hexanol (SMI) à l'électrode de travail de l'ensemble des 16 capteurs et incuber pendant 50 min. Ceci et toutes les incubations de puces de capteurs qui suivent sont réalisées dans une boîte de Petri couvert à la température ambiante. MCH agit comme un agent de blocage, de remplissage dans les fentes, où la sonde de capture thiolé ou HDT n'est pas présent sur la surface de l'électrode.

2. Préparation des échantillons

1. Transférer 1 ml de culture bactérienne dans la phase logarithmique de croissance _(DO600 ≈ 0,1) dans un tube à centrifuger et centrifuger à 16000 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant de culture. Le culot bactérien peut être traitée immédiatement ou stocké à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
2. Soigneusement remettre le culot bactérien dans 10 pi de 1 M NaOH en appliquant la pointe de la pipette au bottom du tube de centrifugation et de pipetage de haut en bas plusieurs fois. Incuber la suspension à température ambiante pendant 5 min.
3. Neutraliser le lysat bactérien en ajoutant 50 pl de 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 2,5% de sérum-albumine bovine mM (BSA) et 0,25 d'une sonde de détection de fluorescéine modifié. Incuber le lysat neutralisé pendant 10 min à température ambiante. Sondes de détection fluorescéine modifiés s'hybrident avec des molécules cibles d'ARNr bactériens.

3. Capteur électrochimique Assay

1. Laver le SMI de la puce du capteur avec déminéralisée H ₂ O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
2. Appliquer 4 de lysat bactérien neutralisé à l'électrode de travail de chacun des 14 capteurs et incuber pendant 15 min. Complexes sonde-cible s'hybrident détecteur de sondes de capture immobilisées thiolés.
3. Appliquer 4 l de 1 nM de transition oligonucléotide à 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 2,5% de BSA et 0,25 μ M fluorescéine modifié sonde de détection à 2 capteurs de contrôle positif (utilisé pour la normalisation du signal) et incuber pendant 15 min.
4. Laver la puce du capteur avec déminéralisée H ₂ O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
5. Appliquer 4 ul de 0,5 U / ml anti-fluorescéine-HRP à 1 M tampon phosphate, pH 7,2, contenant 0,5% de caséine à l'électrode de travail de l'ensemble des 16 capteurs et incuber pendant 15 min. L'anti-fluorescéine-HRP se lie aux sondes de détection de fluorescéine modifiés immobilisés.
6. Laver la puce du capteur avec déminéralisée H ₂ O pendant 2-3 sec et sec sous un courant d'azote pendant 5 sec.
7. Appliquer un film autocollant bien à la surface de la puce du capteur et la charge dans le support de la puce capteur. Pipette 50 ul de substrat TMB sur les 16 capteurs et fermer le support de puce capteur.
8. Obtenir amperometry et les mesures de voltampérométrie cycliques pour les 16 capteurs en utilisant le lecteur de puce Hélios. Courant ampérométrique est proportionnelle à la vitesse de TMB réduction sur la surface du capteur (voir Figure 1).

Résultats

Nous décrivons un dosage électrochimique qui est structuré de manière similaire à un test ELISA sandwich. Comme le montre la figure 1, la cible d'ARN ribosomal (ARNr) l'hybridation avec des sondes de capture et de détection est développée par une réaction d'oxydo-réduction catalysée par HRP conjugué à des fragments d'anticorps anti-fluorescéine qui se lient à la liaison 3 'fluorescéine sur la sonde de détection. Un élément important de la sensibilité du dosage est...

Discussion

Le test de détection électrochimique décrite ici permet la détection rapide de cibles d'acides nucléiques. La sensibilité et la spécificité dépendent en partie de l'énergie libre de l'hybridation cible-sonde, qui à son tour dépend de la longueur et la teneur en GC de la capture et sondes de détection. Nous effectuons généralement les étapes d'hybridation à température ambiante (~ 20 ° C) ^{5, 6.} Toutefois, les étapes d'hybridation (3.2 et 3.3) peuvent également être eff...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-mercapto-1-hexanol (MCH)	Sigma	451088	Store at room temperature
1,6-hexanedithiol (HDT)	Sigma	H-12005	Store at room temperature
Thiolated capture probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Fluorescein-modified detector probes	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Bridging Oligonucleotide	Operon	N/A	Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C
Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments	Roche	11 426 346 910	Store at 4 °C
Helios Chip Reader	GeneFluidics	GFR-2009
Sensor Chip Mount	GeneFluidics	GFR-003
Film well sticker	GeneFluidics		Shipped with sensor chips
Bare gold 16-sensor array chips	GeneFluidics	SC1000-16X-B	Store in 100% N2 at room temperature
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906	Store at 4 °C
1M Phosphate Buffer, pH 7.2			0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2
Blocker Casein in PBS	Pierce	37528	Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C
Table 1. Reagents and Equipment.