Oclusão bilateral artéria carótida comum como um estímulo pré-condicionamento adequados para induzir a tolerância isquêmica início da Isquemia Cerebral Focal

Resumo

Existem evidências, que o pré-condicionamento isquêmico (PC) - um desafio isquêmico não-prejudicial ao cérebro - confere uma proteção transitória a um insulto isquêmico prejudicial subseqüente. Nós estabelecemos a oclusão da artéria carótida comum bilateral (BCCAO) como um estímulo pré-condicionamento isquémico para induzir tolerância precoce (TI) para a isquemia cerebral focal transiente (induzida pela oclusão da artéria cerebral média, MCAO) em C57BL6 / J mice.

Resumo

Existem evidências, que o pré-condicionamento isquêmico - um desafio isquêmico não-prejudicial ao cérebro - confere uma proteção transitória a um insulto isquêmico prejudicial subseqüente. Nós estabelecemos a oclusão da artéria carótida comum bilateral como um estímulo pré-condicionamento isquémico para induzir tolerância no início da isquemia cerebral focal transiente em ratos C57BL6 / J. Neste vídeo, vamos demonstrar a metodologia utilizada para este estudo.

Introdução

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma doença com uma elevada taxa de mortalidade e um enorme fardo socioeconómico ^1. Apesar experimentais e clínicos esforços científicos intensivos ao longo das últimas décadas, as opções de tratamento para pacientes com AVC isquêmico agudo permanece muito limitada ^2. Em contraste com isso, aumento do percentual de idosos nos países desenvolvidos vai aumentar drasticamente a incidência e prevalência de pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico nas próximas décadas ^3. Portanto, existe uma necessidade premente de novas estratégias de tratamento em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico.

Uma abordagem é a de obter uma maior compreensão dos mecanismos de adaptação endógena de cérebro de lidar com um estímulo nocivo. Esta neuroprotecção derivado do cérebro, também conhecido como pré-condicionamento isquémico (PC) ou tolerância isquémica (TI) e descreve um fenómeno, no qual um estímulo nocivo não-nocivo aplicado ao cérebro, induz uma resistência transientecontra um subsequente insulto isquémico prejudicial ^4. Ela ocorre em duas janelas de tempo diferentes: início de TI, o que ocorre dentro de minutos a algumas horas após o PC e atrasou TI, que precisa de uma latência de um par de horas para ocorrer ^4.

Até agora, as pesquisas sobre TI no cérebro tem se concentrado em atraso TI. Muito menos se sabe sobre os mecanismos de início de TI. O objetivo deste estudo é estabelecer a oclusão bilateral da artéria carótida comum (BCCAO), que é um estímulo criado para induzir atrasou, como um estímulo PC adequado para induzir início de TI à isquemia cerebral focal transitória (induzida pela oclusão da artéria cerebral média, MCAO) em ratinhos C57BL6 / J.

Durante os dois procedimentos cirúrgicos (BCCAO e MCAO), foi realizado monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) pelo laser Doppler (LDF).

BCCAO foi realizada em ratos anestesiados e respirando espontaneamente. Ambas as artérias carótidas comuns (CCA) foram expostose tapada durante 60 seg seguido de 5 min de reperfusão. Esta sequência / reperfusão BCCAO foi repetido duas vezes. Após a cirurgia, os ratos recuperaram rapidamente e não mostrou sinais de comprometimento funcional. A fim de excluir, que o protocolo BCCAO descrito acima não resultou em morte celular atraso no cérebro, foi realizada uma TdT mediada dUTP-biotina nick rotulagem final (TUNEL) coloração 72 horas após BCCAO (ou cirurgia sham) em um grupo separado.

MCAO é um modelo amplamente estabelecida para a indução de isquemia cerebral focal em roedores ^5-7. Os procedimentos cirúrgicos foram realizados com procedimentos operacionais padronizados (POP) ^8. Depois de expor CCA esquerda, um monofilamento de silicone coberto foi introduzida no CCA distal, avançado através da artéria carótida interna (ICA) para o círculo de Willis até que a artéria cerebral anterior (ACA) e, desse modo, a origem da artéria cerebral média ( MCA) foi ocluído durante um período de tempo definido. No presente estudo, nósutilizado 45 min de MCAO, o que normalmente resulta em lesão isquémica no território MCA envolvendo as áreas do corpo estriado e corticais cerebrais.

Em nosso estudo, analisamos o perfil temporal do início de TI usando BCCAO como o estímulo PC. Nossos dados indicam que o intervalo de tempo ideal entre BCCAO e MCAO para induzir o início de TI é de 30 min.

Neste vídeo, vamos dar uma demonstração de ambos os procedimentos cirúrgicos, ou seja, BCCAO e MCAO.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste artigo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Alemanha.

Procedimentos pré-cirúrgicos

1. Preparação de monofilamentos

1. Para a preparação de filamentos intraluminais, suturas de monofilamento de nylon 8-0 foram utilizadas e foram cortados com um comprimento de 13 mm cada.
2. Para o revestimento dos monofilamentos, Xantopren M mucosa (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Alemanha) foi utilizado activada pela adição de uma gota de uma solução de activador (Activator, mais universal, a Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Alemanha).
3. O monofilamento foi puxado lentamente através do silicone, até que foi completamente coberto com ele. Ao fazê-lo, o monofilamento seriam igualmente coberto por silicone. Evite esperar muito tempo porque o material de revestimento ativado se tornará firme e seca rapidamente.
4. Antes de o silicone começa a solidificar, Recomenda-se para retirar o excesso de silicone a partir do filamento, puxando-o sobre uma folha de papel. Ao fazer isso, a camada de silicone pode ser diluído para uma espessura aproximada de 200 um.
5. A base do monofilamento silicone coberta foi preso em massa de modelar, a fim de deixá-lo secar durante a noite.

Comentário: Idealmente, só esterilizada ou, pelo menos, monofilamentos desinfectadas deve ser usado para assegurar a esterilidade no local cirúrgico. Na prática, a esterilização ou desinfecção dos monofilamentos feitos à mão é muito difícil, porque a qualidade dos monofilamentos podem piorar ^9. Portanto, pode ser preferível utilizar monofilamentos estéreis disponíveis comercialmente em seu lugar.

2. Preparação de instrumentos cirúrgicos e dos animais

1. Todos os instrumentos cirúrgicos foram mantidas em 70% de álcool etílico. Além disso, antes de cada novo procedimento cirúrgico, todos os instrumentos cirúrgicos foram cuidadosamente limpos and desinfectados com 70% de álcool etílico.
2. A área cirúrgica foi completamente desinfectados com 70% de álcool etílico em todos os animais antes da transecção. Os sites de desinfecção foram autorizados a secar completamente antes de executar as incisões. Corte adicional da pele não foi realizada, pois isso pode causar microabrasions e inflamação da pele posterior ^9.

Os procedimentos cirúrgicos

3. Posicionamento da Sonda LDF e Monitoramento LDF

1. Para a indução da anestesia, os ratos foram expostos a uma mistura gasosa constituída por 30% de oxigénio, 70% de N ₂ O e 2,5% de isoflurano utilizando um vaporizador. Para manutenção da anestesia, a concentração de isoflurano foi reduzida para 1,5%. Ratos estavam respirando espontaneamente via máscara de respiração durante todo o procedimento cirúrgico.
2. A sonda de temperatura retal foi inserido e os ratos foram fixados ao quadro estereotáxico expondo a cabeça parietal. Durante a cirurgia, os ratos estavam descansando em umtermostato controlado almofada de aquecimento, assegurando uma temperatura constante de núcleo de 37,0 ± 0,5 ° C. Uma incisão na linha média sagital (~ 1 cm de comprimento) foi realizada para expor o crânio parietal.
3. O lado esquerdo do crânio foi cuidadosamente dissecado e uma sonda de fibra óptica foi fixada directamente ao crânio 2 milímetros caudal ea 5 mm lateral desde bregma usando cola instantânea. Em seguida, os bordos da ferida, foram cuidadosamente adaptado para evitar a hipotermia cerebral, bem como infecções.
4. O mouse foi se virou para expor o lado ventral do pescoço. A sonda de fibra óptica foi conectado ao dispositivo de LDF (PeriFLUX System 5000, Perimed, Järfälla, Suécia) através de ligação do adaptador de sonda (Master Sonda 418-1, Perimed; Järfälla, Suécia).

Comentário: Ao girar o mouse, a sonda de fibra ótica deve ser dobrado com cuidado, a fim de evitar que ele rompe a partir do crânio.

5. O dispositivo FDL foi ligada a um computador portátil comcomputador. A gravação contínua de valores FDL foi iniciado usando PeriSoft para Windows (versão 2.50, Järfälla, Suécia). Figura 1 demonstra o curso médio CBF obtida de dez gravações FDL durante BCCAO e reperfusão.

4. Oclusão bilateral artéria carótida comum

1. A anestesia foi mantida como descrito em 3.1. Rato foi colocado em suas costas. Cauda e patas do animal foram fixados para a almofada de aquecimento com fita adesiva. A incisão mediana ventral sagital (~ 1 centímetro de comprimento) foi realizada.
2. As glândulas salivatório foram cuidadosamente separados e mobilizados para visualizar a base de CCA.
3. Ambos foram cuidadosamente CCA de separados das respectivas nervos vagais e veias anexas sem danificar estas estruturas. Manipulações dos nervos vagais pode conduzir a uma disfunção temporária ou permanente do sistema nervoso parassimpático, que tem o potencial para a ocorrência de arr cardíaca significativahythmia ou parada cardíaca até mesmo irreversíveis. Portanto, é crucial para evitar manipulações dos nervos vagais. Um fio de seda 5-0 laço frouxo foi feito em torno de cada CCA.
4. Um pequeno tubo de silicone (2 mm de diâmetro) foi inserido entre o CCA e as suturas de seda em cada lado. Este tubo foi utilizada como uma tala do CCA do, a fim de evitar danificar as paredes arteriais, quando as suturas foram apertadas (Figura 4).
5. Ambos CCA da ocluídas por um minuto, apertando as suturas de seda. Apenas os ratos, em que o sinal FDL foi reduzido a <10% do sinal de linha de base foram incluídos no estudo. Após a reabertura dos dois CCA de um período de cinco minutos de reperfusão foi iniciado. Por FDL foi assegurada uma completa reperfusão. Foram excluídos animais com reperfusão incompleta (ie <90% de recuperação da CBF em relação à linha de base CBF). A sequência de um minuto de BCCAO e cinco minutos de reperfusão foi repetido duas vezes para um total BCCAO duratiem de 3 min. Figura 1 mostra o curso significativo CBF obtida de dez gravações FDL durante BCCAO e reperfusão. Durante o procedimento, é recomendável manter o pescoço ferida húmida usando solução salina normal.
6. Após a última reperfusão, todos os tubos e as suturas, bem como a sonda de fibras ópticas ligada ao crânio foi removido, as feridas foram suturadas e unguento de lidocaína (2% xilocaína; AstraZeneca GmbH, Wedel, Alemanha) foi aplicada várias vezes para as feridas como necessário para gestão analgésico.
7. Ratos foram transferidos para um pré-aquecido (30 ° C) caixa de recuperação (MediHEAT. PecoServives Ltd. Brough, Cumbria, Reino Unido) até que tinha recuperado a consciência completa. Em seguida, os ratinhos foram devolvidos às suas gaiolas para animais.

5. Oclusão da artéria cerebral média

1. Os ratinhos foram re-anestesiado, uma sonda de temperatura rectal foi inserido e os ratinhos foram colocados numa almofada de aquecimento para expor o lado ventral do pescoço. Posteriormente, eles were fixados como descrito na secção BCCAO.
2. Uma ligadura permanente utilizando um longo 7-0 sutura de seda foi feito em torno da esquerda CCA proximal e o segmento foi cuidadosamente removido usando uma braçadeira caudalmente mosquito (Figura 4).
3. Outra ligadura permanente foi feito em torno da artéria carótida externa esquerda (ACE) e o segmento foi puxado para o lado direito do animal (Figura 4).
4. Tecido conjuntivo em torno do ICA esquerda foi cuidadosamente mobilizados e do nervo hipoglosso foi levantado suavemente para obter uma boa visão geral do curso distal do ICA. As curvas ICA esquerdo para a esquerda, enquanto a artéria pterigopalatina (PPA) segue o curso do ACI proximal para a direita (Figura 4).

Comentário: Há uma outra artéria a ser identificado que gira para a direita, em direção caudal. Esta é a artéria occipital, que variavelmente origina a partir da bifurcação CCA ou do prparte oximal da ECA (Figura 4).

5. Um ciclo de sutura solto foi feito em torno da ACI proximal através de um fio de seda 5-0.
6. Usando um pequeno grampo microvascular, a AIC foi temporariamente obstruída distalmente ao laço 5-0 sutura solto (Figura 4).
7. Uma pequena incisão foi feita na parte distal do CCA, pouco antes da bifurcação CCA com uma tesoura microvasculares (Figura 4).
8. Um monofilamento de silicone coberto de pré-seleccionada foi introduzida no CCA através da pequena incisão, e empurrado para dentro do ACI até parar no grampo microvascular (Figura 4).
9. O microclampe foi cuidadosamente removido do ACI, enquanto que o monofilamento foi avançado mais profundamente na ICA até parar (Figura 4). Comentário: Neste ponto, virar a pinça na mão esquerda de modo que você não mantê-lo como uma caneta. Isto ajuda a agarrar o filamento com a pinça mais facilmente.O grampo aplicador vascular deve ser realizada na mão direita. Pode ser necessário para quase apertar a sutura 5-0 solta em torno do ACI, a fim de evitar o sangramento a partir do lado da incisão.
10. A localização exata da ponta do monofilamento foi identificado para verificar se ele foi avançado para o ICA e não para o PPA. Se a ponta de monofilamento foi introduzida no PPA proximal, o filamento foi gentilmente puxado para trás pouco antes do ICA / PPA bifurcação. Foi tentou avançar o monofilamento no ICA, novamente, enquanto puxa suavemente o ICA proximal um pouco para o lado direito. Ao fazer isso, o curso natural da ACI distal foi simulado tornando mais fácil para acessar o ICA.
11. Após o monofilamento foi avançada no ICA quase completamente, o laço frouxo 5-0 sutura ao redor do ICA proximal foi reforçada, a fim de manter o filamento no lugar. Depois, todos os fios de seda foram encurtadas ea pele ferida foi suturada.
12. A perda de fluidos durante a cirurgia foi replentada por injecção ip de 1,0 ml de solução salina normal, Em seguida, o ratinho foi transferida para o quadro de recuperação pré-aquecido até que recuperaram a consciência completa.
13. Para a reperfusão, os ratos foram re-anestesiados e o monofilamento removido, depois foi cuidadosamente o afrouxamento de seda de sutura 5-0 em torno da ICA proximal. Em seguida, o fio de sutura 5-0 foi novamente apertados cuidadosamente, a fim de evitar o sangramento.
14. Após a confirmação da hemostasia completa, a ferida foi suturada pescoço.
15. A lidocaína unguento foi repetidamente aplicado localmente na pele, conforme necessário para alívio da dor e o rato foi transferido para o pré-aquecido (30 ° C) até que a caixa de recuperação completa recuperou a consciência.
16. Uma vez que foi observado um primeiro sinal de um procedimento bem sucedido MCAO, um horário circular do animal. A gravidade do déficit funcional foi quantificada pelo escore Bederson modificado para ratos ^10. De acordo com esta pontuação Bederson modificado, os resultados neurológicos queestá classificada da seguinte forma: 0 (função motora normal), 1 (flexão do tronco e dos membros anteriores contralateral quando o mouse foi levantada pela cauda), 2 (circulando para o lado contralateral quando o mouse foi realizada pela cauda em uma superfície plana, mas normal, postura em repouso), 3 (inclinando-se para o lado contralateral em repouso) e 4 (sem atividade motora espontânea ou morto).

6. BCCAO Sham Cirurgia

Para procedimentos sham BCCAO, os ratinhos foram anestesiados para a duração de um verdadeiro procedimento BCCAO PC, as glândulas foram mobilizados salivação ea do CCA foram expostos. É fundamental que as manipulações diretas para as artérias carótidas ou nervos vagais são evitados durante procedimento simulado. Manipulações do CCA podem danificar a sua camada endotelial, o que pode resultar numa libertação de compostos vasoactivos a partir de endotélio ou induzir trombose local dentro do lúmen arterial. Como conseqüência, os eventos tromboembólicos pode ocorrer após a cirurgia sham. Este seria um grande fator de confusão of thprocedimento e. Por outro lado, manipulações dos nervos vagais pode conduzir a uma disfunção temporária ou permanente do sistema nervoso parassimpático, que tem o potencial para a ocorrência de arritmia cardíaca significativa ou mesmo paragem cardíaca irreversível. Portanto, é crucial para evitar manipulações dos nervos vagais durante BCCAO.

Procedimentos pós-cirúrgicos

7. Infarto Desconto Medidas

Para a avaliação de tamanhos de infarto, os ratos sobreviveram durante 72 horas após MCAO. Em seguida os animais foram profundamente anestesiados, os cérebros foram removidos, snap-congelado em metil, seccionado e corado com hematoxilina (usando o protocolo de Papanicolau) para medições de volume de infarto. Secções do cérebro foram recolhidos em intervalos de 600 micrometros de enfarte e os volumes foram determinados utilizando um analisador de imagem (MCID núcleo 7,0 Rev.2.0, GE Healthcare Niagara Inc) e foi corrigida para o edema de acordo com o método de Lin et ai. ^7,11 .

8. Critérios de inclusão

Foram incluídos apenas os animais que tiveram uma redução CBF LDF medido por mais de 90% em cada um dos três episódios BCCAO. Idealmente, o monitoramento LDF deve ser realizada em ambos os hemisférios cerebrais durante BCCAO. Para a praticabilidade, é realizada a monitorização LDF apenas os hemisférios esquerdo, o que irá ser submetido a MCAO mais tarde. Esta abordagem tem sido descrito antes ^6,12. Reperfusão após cada episódio BCCAO foi necessário para ser completo (ou seja, retorno aos valores basais). Por razões de reduzir o tempo de duração camundongos foram mantidos sob anestesia, não monitorar CBF durante a cirurgia MCAO. Em um estudo piloto com um grupo separado de animais no entanto, acompanhámos CBF por LDF durante a cirurgia MCAO. Neste grupo de ratos, nós sempre medido a redução CBF em 90% em relação à linha de base antes CCA oclusão. Além disso, após a remoção de monofilamentos CBF recuperado a> 90% da respectivavalores basais após oclusão da ACC. Estes critérios são FDL estabelecido na literatura e resultar em volumes infarto consistentes ^7. Somente foram incluídos animais que tiveram uma pontuação Bederson de pelo menos de 1 após a recuperação da anestesia após MCAO. Além disso, apenas os animais que sobreviveram por 72 horas após MCAO e que não mostrou sinais de hemorragia intracraniana foram incluídos no estudo.

Resultados

Nosso protocolo BCCAO resultou em reduções CBF imediatas e profundo (> 90%) quando as duas CCA da ocluídas (Figura 1). A reabertura da CCA é levado a completa reperfusão como monitorizado por LDF (Figura 1). Depois de PC, os animais não apresentaram sinais de incapacidade funcional. Além disso, não houve mortalidade. Coloração de TUNEL realizada 72 horas após a BCCAO num grupo separado de animais não mostraram sinais de morte celular retardada no cérebro após BCCAO (dad...

Discussão

Em nosso estudo, nós mostramos que três seqüências de BCCAO, cada um com duração de um minuto, seguida de reperfusão por cinco minutos, são um estímulo PC isquêmico adequado para induzir início de TI.

Além disso, demonstrámos que o protocolo utilizado é o pré-condicionamento de um procedimento invasivo e menor segurança sem morbidez pós-operatória digno de nota, não há sinais de apoptose no tecido cerebral e nenhuma mortalidade. Vários protocolos de pré-condicionamento ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the instrument	Company	Catalogue number/model
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	SteREO CL 1500 ECO
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	David Kopf	Model 930
Scissors	FST	91460-11
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Mircovascular clamp	FST	00398-02
Clamp applicator	FST	00072-14
Springscissors	FST	15372-62
Needle holder	FST	12010-14
Needles	Feuerstein, Suprama	BER 562-20
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama