神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

要約

小説としてルシフェラーゼおよびin vivoイメージングシステム（IVIS）を活用することで臨床開発が発生する前に病気のエンドポイントを識別することを意味します。 IVISは、私たちは今後の研究のために、より正確な疾患モデルを提供し、リアルタイムで複数の日にわたって脳炎ウイルスの侵入を可視化することができました。また、私たちは高速に現在利用されている動物モデルよりも抗ウイルス薬やワクチンの潜在的な保護機能を識別することができました。複数の時点にわたって個々の動物を利用する能力は、病気の研究のより人間的な、より科学的な手段を確保し活用動物に減少動物要件、コスト、および全体的な罹患率を保証します。

要約

イメージング技術の近代的な進歩は、ウイルス研究が達成されるようにさらなる開発と改良を奨励しています。当初はヒュームの3R（リデュース交換、還元、リファインメント）でラッセルとBurchによって提案された、科学研究における動物モデルの利用が科学的正確さとスピードを向上させながら、動物の使用量を削減する新たな方法論を識別するために、一定の圧力の下にある。ヒュームのプリンシパルへの主要な課題は、しかし、動物の疾病の罹患率と全体の数字を削減しつつ、研究は統計的に正確であることを確認する方法です。ワクチンの有効性の研究は、現在、統計的に有意であると見なされるためには、動物の多数を必要とし、多くの場合、免疫防御の識別のための高い罹患率と死亡率のエンドポイントにつながる。我々は徐々にリファレンスによって、中枢神経系（CNS）の侵入を追跡するためにホタル生物発光酵素と一緒にin vivoイメージングシステム（IVIS） で利用マウスモデルにおけるphaliticウイルス。典型的には、病気は、比較的ゆっくりと進行する、しかしウイルス複製は、特に中枢神経系内で、迅速であり、多くの場合、致命的な結果につながることができます。 TC83-Lucを用いたマウスの鼻腔内感染後、弱毒ベネズエラウマ脳炎ウイルス株は、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するように改変、我々は、少なくとも3日臨床疾患の症状の開発前に脳内でのウイルスの複製を視覚化することができます。我々は臨床症状が発現する前に速やかにTC83-Lucの感染症に対する治療薬およびワクチンの保護を識別することができるキー脳炎疾患発症のエンドポイントとして中枢神経系への浸潤を利用。 IVIS技術により、我々は動物数および罹患率を低減しつつ、薬物治療やワクチンの迅速かつ正確なテストを実証することができます。

プロトコル

1。動物の準備

1. 動物の到着：動物バイオセーフティレベル2（ABSL2）施設への到着時に、動物に、新しい環境に順応するために2日以上を可能にします。この休息期間に続いて、自分の健康と全体的な物理的な外観を評価するために動物を検査する。
   1. 蛍光レポーターを利用するとき、それはGIの自家蛍光とバック​​グラウンド信号の量を制限するためにアルファルファフリーダイエット上のすべての動物の科目を配置することが重要です。
2. 動物を剃る：撮像中に頭蓋領域から検出された生物発光信号を改善するために、すべての動物の頭を剃る。酸素ガスの混合物で動物を麻酔し、イソフルラン気化。動物は完全に麻酔したら、頭を剃ること電気バリカンを使用しています。一度シェービングを終え、ケージに動物を戻すと麻酔の影響から完全に回復のために守ってください。
3. バイオメディックデータシステム（BMDS）トランスポンダ挿入（動物は完全に麻酔をかけている間、マウスのシェービング後に場所を取るために）：低侵襲の手段のため事前にプログラムされBMDS無線トランスポンダは、各マウスの背部皮下に温度インプラントを追跡する。これらのトランスポンダは、無線識別と温度記録が可能になります。トランスポンダの移植後、傷口に獣医グレードの組織接着剤を適用します。
4. ベースラインコレクション：感染する前に、すべての動物のためのベースライン温度と重量を記録する。マウスは麻酔下にある間眼窩（RO）のブリードスループラーク減少中和試験（PRNT）分析のために血液を採取します。採血後、潜在的な二次的細菌感染を減らすために獣医抗生物質眼軟膏を適用します。このベースラインコレクションは、動物がマウスに起因する応力に麻酔下に配置​​された回数を考慮して完了する必要があります。今後のROのコレクションマウスを麻酔下にまだある間、hould、イメージング後に完了する。 ROから収集された最大血は200μl程度になるはずです。
5. 感染症：前述のように麻酔下でマウスを配置します。鼻腔感染によって緩衝生理食塩水（PBS）で希釈されたリン酸を40μlの総体積で^{5×10 6〜5×10 7 pfuの} TC83-ルシフェラーゼの用量を用いた鼻腔内経路を介して接種する。感染後、彼らの住宅ケージ内にマウスを置くと回復を観察します。

2。動物イメージング

免責事項：すべての回で彼らの住宅の単位、生物学的安全キャビネット（BSC）、またはXIC封じ込めボックス内でマウスをおいてください。このプロトコルのための承認されたのBSCは、クラスIIタイプB1またはB2です。

1. 15 mg / mlの濃度で腹腔内（IP）ルシフェリンの体重1グラム当たり10μlのすべての動物を注入します。
   1. Ampligenを受けたマウスはinjecteされるそれらのグループに基づいて-4時間後に感染または48時間後に感染症で12.5 mg / kg体重の用量でDのIP。
2. ルシフェリンの注射の前に、XIC-3封じ込めボックス内の適切なフィットを保証するために、3つのグループにマウスを分ける。
   1. すべての画像は、手順全体で角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏剤/潤滑剤を使用しています。
3. LivingImageソフトウェアを開き、イメージングボックスを準備するために初期化を押し、設定した自動保存、自動（自動で露光時間がLivingImageソフトウェア3.2およびそれ以降の新機能である）への露光時間、Cへのフィールドを表示したり、開くことがフィルター;フィールドビューのあなたがイメージングであるマウスの数に基づいて行われ、その他のイメージングプロジェクトのために必要に応じてフィルタを最適化することができる。
4. エアチャコールフィルタの期限が切れていないことを確認し、酸素タンクがいっぱいで、イソフルランリザーバが満たされている。私はXIC-3に電気テープの小さなストリップを置き撮像時に動物の動きを減らすことを支援ゾル化ボックス。
5. 3〜5分間（ふたが開いている）イソフルラン誘導チャンバ内にセクション2.1と場所で説明したようにルシフェリンのIPをマウスに注入します。
6. 5分後、誘導チャンバーの蓋を閉めるとイソフルランのフローを開始する。麻酔は、約2.0リットル/分に設定酸素流量で約3〜5％で運転される。一度完全に無意識のさらに30秒待つとXIC-3分離ボックスにマウスを移す。この手順としてイソフルランの掃気安全が誘導室（IVISユニットは独自のパッシブフェアキャニスターが含まれているとXIC-3封じ込めボックスが直接イン/アウトのソケットに接続してから、イソフルランの損失も含まれるために利用されてバイオセーフティキャビネットができますを確認します）が含まれている麻酔の流れを確保しています。
   1. 添付イソフルランコネクタ付きXIC-3分離ボックスにチップ/グループ数に基づいてマウスを転送dが開きます。彼らは静かにテープストリップで休んで頭と胸骨の横臥にレイアウトされているので、マウスを置きます。
7. cavicideエタノール、スプレー手とXIC-3の底部とXIC封じ込めボックスを拭うと、IVISイメージング室に移す。一度撮像部内側封じ込めボックスに麻酔を再接続します。
8. 後のルシフェリンの注射後10分、リビングイメージソフトウェアを使用して画像をマウス。
9. 開いたフィルターを使用した初期画像に続いて、配列分析および生物発光ホタルルシフェラーゼのイメージウィザードのセットアップを使用してDLIT 3次元イメージングを開始する。このイメージングプロセスは4-5分かかりますし、目的のマウスの数に関連する視野で完了する必要があります。
   1. 生体外分析は、脳の可能性は、次剖検およびコレクションです。 、滅菌シャーレに脳を置き上に株式ルシフェリンの50から100μlを垂れると、IMA内の場所ボックスを変更する。
10. DLITイメージングの完了時に15から17分後の感染で第二のオープンフィルタ画像を完成させます。配列解析が切れていることを確認して、ビューとフィルタ設定のフィールドは、以前の設定に戻ります。

3。マウスおよびデータ解析を返す

1. イソフルラン気化器の電源をオフにし、バイオセーフティキャビネットにバックXIC封じ込めボックスを転送します。
2. 彼らの住居ユニット内に戻るマウスを置くと、背面筐体ラックの適切な消毒剤と場所と外観を吹きかけ、上部を閉じます。
   1. マウスは完全に麻酔から回復していることを確認します。
3. 撮像が完了するまでの実験が必要であるように上記の手順を繰り返します。
4. は、BSCを消毒装置をシャットダウンして、さらに分析するために外部の研究室の場所にすべてのデータを転送します。
5. データを分析し、IVIS結果UTIに基づいて3次元画像を生成LivingImageソフトウェアをlizing。
   1. 画像が適切に指向していて、照明/カラーバランスが設定されていることを確認します。ツールパレット内のオプションは、画像調整、修正、画像情報、およびROIツールが含まれています。
   2. 場所に基づいて、特定の信号強度を識別するために、ROIの形状を利用しています。
   3. 、マウス本体を強調するために表面形状を再構成3D DLIT再建を初期化し、地形復興に臓器マップを設定するには、線形近似を使用しています。
6. さらにウイルスの滴定分析は血液や臓器のコレクションを介して完了することができます。本研究では滴定を改変イーグル培地（MEM）で脳組織の均質化を経て完成しました。ホモジネートを段階希釈し、我々は1時間Vero細胞の6ウェルプレートを感染させた。細胞は1.5％agarose/2xMEMオーバーレイで覆われ、37℃で2日間インキュベートした。細胞を30分間、10％ホルマリンで固定して染色したクリスタルバイオレット。

結果

ウイルス複製が中央CNS（ 図1）に鼻の領域から移動すると、遺伝的に改変されたウイルスで、TC83-ルシフェラーゼ、我々は、生物発光信号強度の増加を見た。高いウイルス複製速度のために、我々はベクトルにベクトルや動物の免疫応答に依存する生物発光信号のハイレベル（ 図2A）を参照してください期待しています。我々は、CNS内のウイルス複製のピ...

ディスカッション

このプロトコルは 、in vivo で解析するための撮像面をカバーしていますが、それは今後の研究のための重要な要因として、生物発光ベクトルを認識することは重要である。ルシフェラーゼの発現用ベクターとしてTC83当社の利用、VEEVの弱毒ワクチン株は、酵素を多量に前述の^1〜4としてCNSにおけるウイルスの高い複製速度に起因する生産されていることを保証します。野?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
D-ルシフェリン
イソフルレン
Xenogen IVISシステム（スペクトラム）	キャリパーライフサイエンス
XGI-8ガス麻酔システム	キャリパーライフサイエンス
XIC-3封じ込めボックス	キャリパーライフサイエンス
LivingImage 4.0ソフトウェア	キャリパーライフサイエンス
テレメトリ/識別チップ	バイオメディックデータシステムズ	IPTT-300	動物IDとテンパーature
26 GX 3月8日 "針のBDインテグラ1ミリリットル結核シリンジ	フィッシャー·サイエンティフィック	305279
獣医ボンド組織接着剤	フィッシャー·サイエンティフィック	NC9259532
Vetropolycin眼科用軟膏	ウェブスター獣医製品	78444656
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水1Xバッファ付き	インビトロジェン	14190-144
BMDSチップリーダー	バイオメディックデータシステムズ	DAS-7007S
DAS-HOSTのソフトウェア	バイオメディックデータシステムズ		プローブ情報をダウンロードするために使用