DNAワクチンの送達のための新しいアプローチとしてタトゥー皮膚

要約

皮膚の入れ墨は、皮内送達DNAワクチンへの強力かつ安全な方法です。ここでは、DNAプラスミドエンコードEGFPは実験用マウスの皮膚に刺青で配信されており、皮膚細胞におけるEGFPの発現は、その後共焦点顕微鏡で検査されます。

要約

核酸ベースのワクチン接種は、成長、興味のあるトピック、免疫学的に重要な抗原をコードする、特にプラスミドDNA（pDNA比）です。人工のpDNAがワクチンに投与された後、それは転写され、免疫システムからの応答を誘発することができる免疫原性タンパク質に翻訳されています。 DNAワクチンを提供する多くの方法が研究されてきたが、各配信ルートは独自の利点と落とし穴があります。皮膚の入れ墨は、安全で費用対効果の高い、そして便利で斬新な手法です。また、針を招いパンクはまた強力なアジュバントとして役立つかもしれません。ここで、我々は）刺青デバイスを使用してマウスモデルにおけるプラスミドDNAのエンコーディング強化緑色蛍光タンパク質（PCX-EGFP）の皮内送達を実証し、b）の共焦点顕微鏡を用いた皮膚細胞におけるEGFPの効果的な発現を確認。

プロトコル

1。プラスミドDNA精製

1. 大腸菌 DH5αコンピテントセルに真核生物のプラスミドDNAエンコードEGFP（PCX-EGFP）を変換します。空のPCXベクトルもまたネガティブコントロールとして使用することもできる。
2. 文化や収穫DH5α 大腸菌細胞およびQiagen EndoFreeプラスミド精製ハンドブックによるとpDNAを清める。
3. フィルタのpDNA0.22μmのPVDFの滅菌フィルターを通して溶液、使用するまで-20℃で保管してください。

2。タトゥーシステム準備

1. メーカーの指示に従って電源ユニットにハンドヘルドユニットとコントロール·ペダルを接続します。
2. 約100 Hzに針発振周波数を設定します。我々が選んだの入れ墨装置（ステルスロータリータトゥーシステム）については、電源装置上のダイヤルは4ボルトに設定する必要があります。ユーザー·マニュアルまたは他の刺青システムのテクニカルサポートを参照してください。
3. 針ARを殺菌使用前検査。私たちは、動物あたり1針アレイの使用をお勧めします。針は、石鹸水で洗浄し、オートクレーブ処理された後に再使用することができます。
4. ハンドヘルドユニットに針アレイをインストールして、緩くプラスチックグリップを取り付けます。
5. 上下プラスチックグリップを移動することによって適切な設定に針の深さを調整します。我々は、マウスの実験では約0.5mmの針の深さを使用していました。
6. 針の深さが適切に設定されているプラ​​スチック製のグリップを締めて、刺青システムを使用する準備ができている。

3。動物シェービング

1. 刺青治療のためのサイトを選択してください。このサイトは比較的、しっかり平らで、肉質の皮膚の領域、例えば、動物のhindlegの側でなければなりません。
2. 動物の体重によるとケタミン（90 mg / kg）およびキシラジン（5 mg / kg）の混合物を用いてBALB / cマウスを麻酔。他の動物の場合も、あなたの機関の麻酔のガイドラインを参照してください。
3. チェック動物を確認するために、その足をつまんで動物の反​​射神経は正常に麻酔をかける。
4. ゆっくりと慎重に、動物の後肢で髪をスリム化するために、電気トリマーを使用しています。計画的な刺青サイトおよびその周囲から毛を削除します。
5. 使い捨ての安全カミソリの残留短い髪を削除します。動物の皮膚を切らないように注意してください。脱毛クリームは、代替脱毛方法として使用されるかもしれないことに注意しますが、我々は、脱毛クリームの上にシェービング好む。
6. 必要に応じて圧縮空気で肌からの迷光カット毛を取り除きます。

4。タトゥーによるプラスミドDNAの送達

1. 免疫化プロトコルが以前に確立されている場合は、適用されるべきDNA溶液の投与量とボリュームは、それに応じて計算されるべきである。私たちは、刺青のプロセスを管理しやすくするための実用的なような小さなボリュームとして使用することをお勧めします。このEGFPのデモでは、詐欺でDNA溶液7.5μlを使用約1cm ²の刺青面積上に塗布した後、0.25 mg / mlでのセンタリング。予防接種の実験のために、より高いpDNAの濃度が強い免疫応答^1,2を誘導する必要がある場合があります。
2. 刺青のサイトに直接ピペッティングによりDNA溶液を適用します。あるいは、液体が針とプラスチックグリップの先端との間に中断されているので、ピペッティングによりプラスチックグリップにDNA溶液をロードします。デモ用のビデオを参照してください。私たちは2つの方法の間には顕著な差は認められなかった。しかし、プラスチックグリップに溶液をロードすると、たとえば、垂直皮膚表面上で有利であるかもしれません。
3. 針の振動を開始し、刺青のサイトで動物の皮膚に軽い圧力で針アレイを配置します。そして、全体の刺青領域上プラスミドDNAを提供するために直線的に優しく、ゆっくりと振動針を動かす。針とを避けるために皮膚との間に90度の角度を維持する皮膚に裂傷。
4. 肌を守ってください。摩耗や炎症は正常である。出血が発生した場合は、刺青のプロセスを停止し、針の深さを減少させる。
5. 約1分間、針の動きを続行し、入れ墨のプロセスを停止します。
6. 刺青のサイトに局所鎮痛剤の薄層を適用するためにきれいな綿棒を使用してください。スルファジアジン銀クリームSSD（クリーム）またはネオスポリン軟膏などの局所鎮痛薬は、動物の痛みや苦痛を軽減することができます、そして、したがって、それは麻酔が切れる前にそれらを適用することをお勧めします。痛みや苦痛の徴候（歩行の変化、非アクティブ）の翌日に動物を観察。徴候が持続する場合は、鎮痛クリームを再適用します。

5。抗原発現の確認

1. 刺青治療（別のpDNAコンストラクトは異なる発現時間を必要とするかもしれないことに注意してください）48時間後に、マウスをCO ₂麻酔により安楽死させています。他の用動物は、貴機関の安楽死のガイドラインを参照してください。
2. 刺青部位の皮膚を切開し、4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒド中で組織を固定します。
3. 70％エタノールを用いて組織をすすぎ、イメージングのための1×PBSにそれを転送します。
4. EGFPの信号をチェックするために、共焦点顕微鏡を用いて組織全体を調べます。代わりに、皮膚組織をパラフィンワックスに埋め込まれており、蛍光顕微鏡下のセクションで調べることができます。

結果

509 nmでの488nmおよび発光ピークの励起ピークとEGFPの発現は、マウスの皮膚細胞で観察することができます。 DNAの1.875μgの用量から、プラスミドの約3×10 ¹⁷コピーを含む、我々は一般的に²エリアに入れ墨1センチメートルで10月20日EGFPの信号を観測しました。トランスフェクトされた細胞のこの比較的低い数は以前の研究³の結果と一致している。 EGFP発現（ 図1）?...

ディスカッション

それを操作する必要があり、または、ライブまたは弱毒病原体⁴にワクチンを公開していないとして、DNAワクチンは、従来のワクチン接種戦略よりも安全と考えられている。しかし、DNAワクチン接種の結果は送達経路に大きく依存します。皮膚は、ランゲルハンス細胞、樹状細胞^1、従って、免疫原性およびアクセス^5,6の容易さの点で予防接種のための理想的なサイト?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
PCX-EGFPプラスミドDNA	クロンテック
STEALTHロータリータトゥーシステム	ワールドワイドタトゥーサプライ	STEALTH-L
入れ墨の針	ワールドワイドタトゥーサプライ	1207RSB
EndoFreeプラスミドマキシキット	キアゲン	12362
0.22μmの滅菌フィルターPVDF	ミリポア	SLGV013SL
電気毛のトリマー	市販の
使い捨て安全カミソリ	市販の
シルバースルファジアジンクリーム	ワトソン	NDC 0591-0810-55
ケタミンHCL		NDC 0856-2012-01
Zylazine滅菌溶液		NADA 139から236