自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

要約

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。

要約

我々は、α-シヌクレイン、パーキンソン病に関連する遺伝子の転写調節因子を同定するための迅速かつ安価なハイスループットスクリーニングプロトコルを提示する。 293T細胞を一過一遺伝子あたりウェルマイクロプレートフォーマットで、一緒にルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、配列されたORFの発現ライブラリー由来のプラスミドでトランスフェクトされる。ホタルルシフェラーゼ活性は、内部コントロール構築物（ ウミシイタケルシフェラーゼを導くhCMVプロモーター）から発現に対して正規化し、α-シヌクレインの転写時に各ライブラリー遺伝子の効果を決定するために48時間後にアッセイされる。このプロトコルは、96ウェルフォーマットで無菌の液体処理を行うバイオセーフティキャビネット内に封入卓上型ロボットによって促進される。我々の自動化されたトランスフェクションプロトコールは、ハイスループットレンチウイルスライブラリーの産生又はコンジュユニークなライブラリープラスミドの多数の三重トランスフェクションを必要とする他の機能的スクリーニングプロトコルに容易に適用可能でヘルパープラスミドの共通セットでnction。また、市販の、デュアルルシフェラーゼPTC124を採用している試薬、EDTA、および以前のウミシイタケルシフェラーゼを測定し、ホタルルシフェラーゼ活性を抑制するために、ピロリン酸への安価で検証済みの代替を提示する。これらの方法を用いて、7,670のヒト遺伝子をスクリーニングし、α-シヌクレインの68調節因子を同定した。このプロトコルは、関心のある他の遺伝子を対象とする、容易に変更可能です。

概要

キー遺伝子調節要素とそれらに作用する因子を同定する能力は、非常に多くの生物学的プロセスの探査のための基本である。しかしながら、このような特定のニューロン集団のような希少細胞タイプにおいて遺伝子の発現を調節する因子を同定する、挑戦的であることができる。ここでは、α-シヌクレイン（SNCA）の新規な転写調節因子を同定するためのプロトコルを提示し、パーキンソン病に関連し、substantianigraでドーパミン作動性ニューロンに発現している遺伝子は、中脳の緻密領域様部。我々は、293T細胞におけるα-シヌクレイン発現を分解するための高スループット、デュアルルシフェラーゼレポーターインビトロスクリーンを用いてこれを達成する。 α-シヌクレインプロモーターは、第ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドにクローニングする。構成的に活性なプロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼを含む市販のプラスミドを内部対照として役立つ。テサロニケ電子レポーター構築物を、各ウェルが単一のライブラリープラスミドでトランスフェクトされるように、DNA発現ライブラリー由来のプラスミドでマイクロプレート中の293T細胞に同時トランスフェクトする。 48時間後、各レポーターのためのルシフェラーゼ活性は、デュアルグローアッセイを用いて順次測定される。プレートベースの正規化後：（R比F）各ウェルのウミシイタケルシフェラーゼ活性：各ライブラリ遺伝子に応じて、α-シヌクレインの相対発現は、ホタルの比によって推定される。

このプロトコルは、最小限の人員（1-2人）と最小のコスト（マイクロプレートアッセイあたり約3ドル試薬コスト）を使用して、レポーター遺伝子をトランスする能力について多数の遺伝子（週〜2500）をスクリーニングする機能を提供します。遺伝子操作に難治培養ニューロンで研究することが困難である神経細胞の遺伝子の転写調節因子（ 例えば 、α-シヌクレイン）は、この直接機能アッセイで並べて比較することができる。私達は私達の中に含まれるプロトコル我々は、従来の手順（説明を参照）で成長させたときに、この領域を含むプラスミドが不安定であることが見出さため、クローニングおよびα-シヌクレインプロモーターを含むプラスミドの増殖のための詳細な方法。また、ハイスループットアッセイ用の市販のデュアルルシフェラーゼ試薬に安価な代替品が挙げられる。このプロトコルは、容易に、または高スループット一過性トランスフェクションを必要とするあらゆるプロセスに関心のある他の調節エレメントを標的とするように適合させることができる。

プロトコル

実験概要については、 図1を参照してください。

1。α-シヌクレインプロモーターを含むレポータープラスミドを準備

α-シヌクレイン遺伝子（ 図2）の調節要素は、上流NACP（アミロイドペプチドの非ベータ成分）ジヌクレオチド反復配列^1,2からのイントロン^2〜3を、約10キロバイトに及ぶ。私たちは、この地域の一部を含む私たちのレポーター構築。私たちは、成長のために必要な特別な手順2イントロンを含むプラスミドは、下記のとおりことがわかった。ルシフェラーゼプラスミド、pGL4.10およびpGL4.75（ 図3）は 、Promega社から市販されており、従来の分子生物学プロトコルを用いて増殖させることができる。

1. 表1の配合表および表2のプライマーを用いて別々のPCRにおけるα-シヌクレインプロモーターの2成分を増幅する。
2. ベリTE（トリス-EDTA）50μlに溶離をQiaquick PCR精製キット（Qiagen）を用いてアガロースゲル上できれいなfyのPCR産物。将来の使用のために-20℃で溶出した0.9kbのフラグメントを格納します。
3. SacIとXhoIで、全体の3.4キロバイトPCR断片の量だけでなく、pGL4.105μgのダイジェスト。子牛腸アルカリホスファターゼ（Roche）を、ベクターを治療し、ゲルがPureLinkクイックゲル抽出キット（Invitrogen）を用いて浄化する。
4. T4 DNAリガーゼ（NEB）を用いて断片とベクターを連結する。 10μlのTE緩衝液に溶出して、PureLink PCRのマイクロキット（Invitrogen）を用いて完了した反応を清掃してください。
5. ELECTROMAX Stbl4テント​​セル（Invitrogen）を20μLに洗浄、ライゲーション反応の2液を変換し、メーカーの指示に従って、エレクトロポレーション。 90分間、225 rpmで30℃のインキュベーター中で振盪する。 100 mg / mlのアンピシリンを含むLBプレート上で2ボリュームを広げ、2日間30℃でインキュベートする。
6. つまようじを使用して、結核の2ミリリットル（テリフィックブロス）への接種のための4-6の小さなコロニーを選択します。 30℃で振とうのO / Nでこれらのミニプレップの文化を育てる
7. PureLink HiPureプラスミドミニプレップキット（Invitrogen）を用いて、各ミニプレップ培養物を1.5mlからプラスミドDNAを精製する。
8. BamHIでミニプレップを消化し、アガロースゲル上で電気泳動。正しいクローンは2.8キロバイトと4.9 KBのフラグメントを生成する必要があります。
9. 新しいLB（ルリアブロス）プレート上の正しいクローンから、残りのミニプレップ文化をRestreakし、2日間30℃で成長する。
10. 小さなコロニーを選択し、1.5ミリリットルのTBスターター培養を接種する。 30℃でO / Nを振るスターター文化が飽和状態に成長させてください。
11. 温めておいた結核の150ミリリットルに全体のスターターカルチャーを希釈し、2日間、30℃で振る。次のステップに進む前に、クローンはreplicati中に変異していないことを確認するために、追加のミニプレップおよび消化のために、この文化の1.5ミリリットルを使用上。
12. PureLink HiPureプラスミドマキシプレップキット（Invitrogen）を用いて、残りの培養物からプラスミドDNAを精製する。この中間体プラスミドの期待利回りは、文化の150ミリリットルあたり50〜150μgのです。
13. ステップ1.2で凍結し0.9kbのフラグメントを解凍する。 1.3〜1.12のKpnIおよびSacIで消化する代わりに、中間プラスミドに0.9kbの断片をクローン化するための手順を繰り返します。ライゲーション、形質転換、選択、および上記のように大量調製（Maxiprep）のために成長する。 BamHIで消化は5.8キロバイトと2.8 KBのフラグメントが得られるはずです。これは、スクリーンに使用されるプラスミドである。

2。スクリーニングのための293T細胞、レポータープラスミド、およびライブラリーDNAを準備

293T細胞は、最初の96ウェルプレートに播種し、翌日、トランスフェクトされる。レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを96ウェルプレートに希釈する。私たちは、マサチューセッツ総合病院（でDNAコアからトランスフェクショングレードのライブラリーDNAのプレートを得た= "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu）を取得します。このプロトコルは、293T細胞の2の同一のプレート（ 図1）に単一のライブラリ版をトランスフェクトし、細胞のこのよう2プレートは、スクリーニングされる各ライブラリのプレートのために播種する必要があります。

注：これらは、ルシフェラーゼアッセイに干渉し、それぞれ、トランスフェクションの際に毒性を高めるように、フェノールレッドや抗生物質を含まない培地中の細胞を成長させる。

1. 各ライブラリープレートは、14％FBSを含有するDMEM中1.5×10 ⁵細胞/ mlの濃度まで再懸濁し、トリプシン処理293T細胞をスクリーニングするために。無菌貯水池（アキシジェン）に注ぐ。
2. 貯水池、2透明底、96ウェルプレート（Corning）、ロボットデッキ上のフィルターピペットチップ（アジレント）のボックスを配置します。ウェル当たり1.5×10 ⁴細胞の密度のため、両プレートの各ウェルに細胞100μlを分注する。
3. 等しい確実にするために低いランプ速度を用いて、2分間50×gで細胞プレートを遠心分離する各ウェルを通して細胞密度。 37℃でインキュベートし、10％CO ₂ O / N.
4. 無血清培地中で5 NG /μlにホタルおよびウミシイタケレポータープラスミドを希釈する。 15ミリリットルコニカルチューブに（容量）ホタルウミプラスミドを5:3の割合で希釈液を兼ね備えています。
5. ピペットで各ウェルに、ライブラリプレートあたり17μLに加え、2月10日μL過剰を分配する96ウェルプレートの各ウェルに結合したプラスミドは、。
6. 上記のようにトランスフェクショングレードのDNAライブラリープレートを取得し、エンドトキシンフリー水で13.3 NG /μlに希釈する。ウェルあたり最小容積は28μLである必要があります。

3。トランスフェクションを行います

画面の2日目に、レポータープラスミドおよびライブラリーDNAを293T細胞にトランスフェクトする。

1. 各ライブラリのプレートには、ポリスチレンチューブに4.3ミリリットルの無血清培地（午前1時40希釈）を用いてRT Optifect（Invitrogen）を107.5μLをミックス。 RTで5分間インキュベートし、そしてN 96ウェル、ポリスチレンV底プレート（グライナー）の各ウェルに（ライブラリープレートあたり）44μLを分注する。
2. 希釈Optifectのプレート、レポータープラスミド（ステップ2.5）、ライブラリのDNA（ステップ2.6）、およびロボットデッキにピペットチップの箱を置きます。
3. 各吸引の間に5μlのエアギャップを挿入して吸引除去するレポータープラスミドの17μlの希釈Optifectの43μL、およびライブラリーDNAの26μL、。ライブラリーDNAは、交差汚染を防止するために、最後に吸引されるべきである。新しいポリスチレンV底プレートにヒントの内容を分配する、ミックス、カバー、および脂質/ DNA複合体を形成することができるように、20分のために確保さ。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、ピペットチップとライブラリプレートを交換し、繰り返してください。
4. Optifect / DNA混合プレートを明らかにし、293T細胞の2プレートをロボットデッキの上に置きます。 DNA混合物を、ゆっくりと、細胞の各プレートに40μLを分注：Optifectの80μlを、ピペットチップの単一のボックスを吸引使用。トランスの場合複数のライブラリ版をfecting、すべてOptifectためリピート：DNAプレート。セルをカバー。
5. 30分間1200×gで細胞プレートを遠心分離する。カバーし、インキュベーターに戻す。
6. 4-6時間のために細胞をインキュベートします。このインキュベーションの間、各トランスフェクトライブラリ版のため、10％FBSおよび10μg/ mlのシプロフロキサシン（CELLGRO）を含む12ミリリットルのDMEMを混合することにより、新鮮な培地を準備。無菌リザーバに新鮮な培地を注ぐ。
7. ロボットデッキに2ロボット先端の箱、細胞の単板、新鮮な培地を含む容器、および廃棄物容器を置きます。細胞から培地を吸引し、100μlのおよび部分的に70％エタノールで充填された廃棄物容器内に分注する。新鮮な培地100μlを、新鮮なヒントを吸引し使用して、徐々に細胞上に分注する。セルのすべてのプレートについて繰り返します。
8. 48時間インキュベーターにプレートを返します。

4。二重ルシフェラーゼアッセイを行う

画面の4日目に、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼアッセイが行われる。

注：デュアルルシフェラーゼアッセイを、表3で説明したように、2アッセイバッファ、3Xホタルアッセイバッファと3X ウミアッセイ緩衝液の連続添加を必要とするホタルおよびウミルシフェラーゼが分泌されない、このように細胞が前にルシフェラーゼ活性を測定するために溶解されなければならない。 。ホタルアッセイ緩衝液は、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼの基質を提供し、 ウミシイタケアッセイ緩衝液は、ホタルシグナルを消光し、 ウミシイタケルシフェラーゼの基質を提供する。

1. 表3に記載したように、各ライブラリープレートについては、ストック溶液から3Xホタルアッセイバッファを8mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに82μlずつ分注する。
2. 各ライブラリープレートについて、また3× ウミシイタケアッセイ緩衝液を12mlを調製し、96ウェルV底プレートの各ウェルに122μlずつ分注する。両方を脇に置きますホタルおよびウミアッセイ緩衝。
3. ロボットデッキで（同じライブラリのプレートからトランスフェクト）ピペットチップの箱、廃液容器、およびセルの2枚を配置します。
4. 各プレートからの培地の吸引物60μLと部分的に70％エタノールで満たされた廃棄物容器に廃棄します。プレートをカバーし、脇に置きます。複数のライブラリプレートをトランスフェクションした場合、プレートのすべてのセットのために繰り返します。
5. 2ピペットチップの箱、3Xホタルアッセイバッファのプレートと、ロボットデッキに細胞プレートのセットを配置します。
6. 3Xホタルアッセイバッファの吸引物40μLと十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。新しいピペットチップへの切り替え、第二のセルプレートのために繰り返します。溶解が完了するまで室温で10分間細胞を置く。複数のライブラリ版をトランスフェクションする場合は、ヒントと細胞プレートのボックスを交換して、繰り返します。
7. ウェルあたり1秒間記録ルミノメーター上の各細胞プレートの各ウェルからの記録発光、。ロボットにプレートを返すデッキ。
8. 2ピペットチップの箱、3X シイタケアッセイバッファープレート、ロボットデッキ上の細胞プレートのセットを配置します。
9. 吸引物60 3X ウミアッセイバッファーのμL、および十分に混合、細胞の第一プレートに追加します。ピペットチップの新しいボックスに切り替えて、第二のセルプレートのために繰り返します。複数のライブラリプレートをトランスフェクトした場合、細胞プレートのすべてのセットのために繰り返します。
10. 上記のように1秒間各ウェルを記録するルミノメーター上のすべてのプレートからの記録発光、。プレートを捨てる。

5。データ解析

1. ウミ信号のカウントによってホタル信号のカウント数で除して各ウェルについて： ウミ発光比（「R比F： "）ホタルを計算します。
2. 井戸の最高と最低の25％を除いた、プレートのR比：各R比を十分に平均Fで、Fを分割することにより誘導値を計算します。
3. 複製物全体に誘導値を平均シングルトランスフェクトライブラリプレート用。 α-シヌクレインを誘導または抑制遺伝子以上の3倍量この画面で「ヒット」とみなされ、さらに検証および二次スクリーニングの対象とされています。

結果

典型的なルシフェラーゼ値、F：R比およびシングルハーフプレート用の誘導値は、図4に示されているだけでなく、H2、32倍誘導剤でヒットに注意してください。過剰な毒性（例えば、よくE3）、または不十分なトランスフェクションした井戸を引き起こす遺伝子は、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼが、平均誘導値の両方のために低い値を生成します。 pGL4骨格との...

ディスカッション

α-シヌクレインはレビー小体^4、疾患のための考えられる特徴的な細胞内封入体の成分としてのパーキンソン病（PD）に関与している。数々のゲノムワイド関連解析は、散発的なPDの^5,6,7リスクの増加とα-シヌクレインに一塩基多型をリンクされています。散発PDよりも一般的であるが、家族性PDはまた、α-シヌクレイン⁸と同様に、α-シヌクレイン遺伝子座^9,10,11、

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
			Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
Coenzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003