Protein Purification méthode sans la détermination de l'affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Résumé

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l'affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Résumé

Caractérisation quantitative des interactions protéine est essentielle dans pratiquement tous les domaines des sciences de la vie, en particulier la découverte de médicaments. La plupart des méthodes actuellement disponibles de détermination K _D nécessitent un accès à la protéine d'intérêt, la production de ce qui peut être fastidieux et coûteux purifiée. Nous avons mis au point un protocole qui permet de déterminer l'affinité de liaison par thermophorèse microscopique (MST) sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le procédé implique une surexpression de la protéine GFP-condensé et la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes. Application de la méthode de STAT3-GFP exprimé de manière transitoire dans les cellules HEK293 ont permis de déterminer pour la première fois l'affinité du facteur de transcription bien étudiée pour des oligonucléotides avec des séquences différentes. Le protocole est simple et peut avoir une variété d'applications pour l'étude des interactions des protéines avec de petites molécules, les peptides, ADN, ARN, et proteins.

Introduction

Caractérisation quantitative de l'affinité des interactions intermoléculaires est important dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale. Reliure constante de dissociation (K _D) est essentiel non seulement dans la découverte de médicaments, mais est également un paramètre important dans la caractérisation d'une interaction binaire dans un système biologique. Méthodes biochimiques utilisées pour la détection des interactions protéine-protéine, comme immunoprécipitation et de la levure de deux écrans hybrides, ne nous informent pas sur la façon dont ces interactions sont serrés, tout en affinité définit si ce complexe particulier existe dans des conditions données in vivo. En processus de découverte de médicaments, le développement de test de liaison est l'un des nécessaire et fréquemment étapes les plus fastidieuses. La plupart des méthodes couramment utilisées pour la détermination K _D incluent la polarisation de fluorescence, ¹ surface technologie résonance de plasmon (SPR), ² radioligand contraignant, ³ isotherme calorimétrie de titration, ⁴ Equilibrium dialyse (ED), ⁵ ultrafiltration (UF), ⁵ et ultracentrifugation (UC). ⁶ Chacun d'entre eux nécessitent des quantités importantes de protéine cible purifiée. Thermophorèse Microscale (MST) est un procédé en plein développement qui détecte un mouvement dirigé de molécules dans un gradient de température microscopique. Toute modification de la couche d'hydratation des biomolécules entraînent un changement relatif du mouvement le long du gradient de température. ⁷ MST est utilisé pour déterminer les affinités de liaison et a été appliquée pour l'étude de la liaison du ligand à des protéines marquées par fluorescence ou ligands fluorescents pour une protéine cible. ^{8, 9} MST permet de mesurer les interactions directement en solution sans la nécessité d'immobilisation sur une surface (immobilisation sans technologie). Pratiquement, toute liaison est accompagnée d'un changement dans le signal MST, même si la taille du changement diffère d'un système à façon significative. Pour la détection de mouvement de la molécule par MST, ils doivent être fluorescentnt. Cette limitation majeure de la méthode peut être transformé en un avantage. Si une protéine est exprimée comme une fusion de la GFP dans tout système, il sera la seule molécule fluorescente et peut donc être étudié sans les isoler du lysat cellulaire ou un système d'expression acellulaire. Génération de lysats de cellules qui permettent de conditions contraignantes avec le minimum d'artefact est le défi majeur. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lysat cellulaire et l'expérimentation MST qui peut être utilisé pour de nombreuses protéines solubles et membranaires.

Protéines STAT sont latents facteurs de transcription cytoplasmiques activés par phosphorylation sur tyrosine en réponse à des signaux extracellulaires et sont impliqués dans de nombreux processus biologiques, y compris l'immunité, l'hématopoïèse, l'inflammation et le développement. ¹⁰ Chez les mammifères, la famille STAT se compose de STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B et 6. Toutes les stats activés sont connus pour se lier à la même séquence d'ADN, dite motif de GAZ, IFN-gamma activé séquence. Toutefois, le transcriptionnel effets de différentes stats sont très différents. ¹¹ En dépit de l'implication dans de nombreux processus pathologiques et des études approfondies produisant plus de 17.000 publications, le K _D d'interactions STAT avec différentes séquences d'ADN n'ont pas été déterminées. Seulement affinité relative des différentes variantes de stats pour motif de gaz a été caractérisé. ¹¹ Difficultés d'expression et purification des protéines sont les principaux obstacles à la caractérisation de sélectivité de liaison de l'ADN stats. Bien que la majorité des études se sont concentrées sur le rôle des stats "activés", qui est devenu synonyme de facteur de transcription Tyr phosphorylée, le rôle de STATS non phosphorylée (U-STAT) dans la régulation de la transcription émerge rapidement. ¹² Cependant, ces mécanismes sont encore mal compris, et il était difficile de savoir si U-stats lie effectivement à l'ADN ou d'agir à travers des interactions avec d'autres facteurs de transcription. Nous avons récemment montré que U-STAT3 peut se lier à l'ADN séquentielleCES différente de motifs de gaz avec une affinité encore plus élevé ^13. L'découverte a des implications importantes pour notre compréhension des fonctions biologiques de cette protéine importante. Nous avons appliqué thermophorèse microscopique afin de déterminer les affinités relatives de STAT3 au gaz et au riche oligonucléotide S +100 (Figure 4). Protocole pratiquement identique a été utilisée pour la détermination de K _D pour la liaison d'un ligand STAT3 différent, un inhibiteur de lipopeptides. ¹⁴ Aucune liaison pour un facteur de transcription liée, GFP-STAT1 qui a été utilisé comme contrôle négatif a pu être détecté confirmant ainsi la sélectivité d'interaction. ¹⁴

Protocole

1. Préparation de lysat cellulaire

Ce protocole est destiné aux cellules adhérentes exprimant une protéine GFP fusionnée. Nombre de cellules nécessaire peut varier entre un minimum de 10 ⁶ à moins de 20 x 10 ⁶ cellules, en fonction du niveau d'expression de la protéine. Par exemple, lysat de cellules HEK surexprimant GFP-STAT3 a été préparé par le traitement des cellules cultivées dans 10 flacons T75 à près de 70% de confluence avec le tampon de lyse 1 ml. Cependant, ce lysat devait être dilué 150 fois pour fournir un niveau optimal de fluorescence pour l'expérience MST. protocole de lyse cellulaire dépend fortement des propriétés et la localisation intracellulaire de la protéine à l'étude. Si vous utilisez des détergents n'est pas souhaitable en raison de l'instabilité des protéines, ultrasons décrit ci-dessous, pourrait être le meilleur choix. Différents additifs peuvent être ajoutés à la mémoire tampon de lyse pour éviter les réactions de modification de protéines: EDTA empêche la phosphorylation, le vanadate de sodium inhibe protéines phosphatases de tyrosine, de sorte quefluorure de sodium est un inhibiteur de Ser / Thr phosphatases.

1. Préparer un tampon de lyse. Pour à extraire faciles protéines cytoplasmiques la composition suivante fonctionne bien: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, et un inhibiteur de protéase cocktail diluées 100 fois (Sigma-Aldrich P2714, composé de 2 mM AEBSF, 0,3 um aprotinine, 130 uM bestatine, 1 mM EDTA, 14 pm E-64, 1 uM leupeptine). Sinon, pour les protéines moins solubles, on peut utiliser un tampon RIPA commercial avec les inhibiteurs de protéase cocktail et des détergents non dénaturants. Gardez le tampon sur la glace.
2. Laver les cellules brièvement avec PBS glacé avec 10 ml de tampon par flacon T75. Gardez les cellules sur la glace pendant 5 min ou jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher du flacon. Grattez les cellules avec un grattoir à cellules à se détacher si nécessaire.
3. Remettre les cellules dans 10 ml PBS glacé et transférer dans un tube à centrifuger pré-refroidi 14 ml de fond rond.
4. Sédimenter les cellules par centrifugation à 400-600 xg à 4 ° C pendant 5 min. Combiner des cellules provenant de plusieurs flacons à ce point if nécessaire.
5. Retirer PBS surnageant et remettre le culot dans 200 ul de tampon de lyse glacé, le transfert de suspension à un pré refroidie 1,5 ml tube Eppendorf.
6. Gardez les cellules sur la glace pour réduire la surchauffe locale. Lyse des cellules avec 3x 10 sec impulsions de sonication à 30% d'amplitude, à l'aide d'un 2-3 mm de pointe pré-réfrigérés. Gardez la pointe en dessous de la surface de minimiser l'écume. Omettre cette étape en utilisant des produits contenant du tampon et incuber sur de la glace pendant 30 min à la place.
7. Corrigez la solution de lysat pour contenir la concentration de sérum physiologique (NaCl 100 mM), si nécessaire en utilisant 5 M de NaCl.
8. Recueillir lysats par centrifugation à environ 26.000 xg à 4 ° C pendant 10 min.
9. Déterminer la dilution du lysat optimal (tel que décrit dans la section 3 ci-dessous) et la quantité de lysat nécessaire pour une titration (généralement autour de 300 pl de lysat pré-dilué).
10. Aliquote du lysat et stocker à température appropriée pour la protéine à l'étude (-80 ° C, dans la plupart des cas).

2. MST sélection de la mémoire tampon et préparation

1. Depuis les interactions protéine-ligand sont tributaires des conditions tampons, la composition du tampon MST est choisie en fonction des propriétés d'un système particulier. Il est généralement avantageux de tester au moins deux tampons différents.
2. Préparer 2 tampons MST 5x. Nous avons eu de bonnes expériences avec ces deux compositions: HEPES (250 mM d'HEPES, pH 7,4, _MgCl2 25 mM, NaCl 500 mM, 0,25% de NP-40) et Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, NaCl 750 mM; 50 mM de _MgCl2, 0,05% de Tween-20). Ajout de BSA (5% dans le mélange liant final) peut aider à prévenir l'adhérence des protéines à des tubes en plastique et en verre capillaires. _NaN3 (0,5 mM) peut également être prévu pour empêcher la croissance de micro-organismes.

3. Détermination de la dilution de lysat optimale

1. Sélectionnez la source d'excitation LED avec la longueur d'onde λ = 470 nm sur l'instrument MST.
2. Chargez capillaires avec la CEll extrait dilué 2 et 10x avec un tampon MST.
3. Exécutez l'opération "Trouvez Capillaires" sur le logiciel de contrôle d'instrument MST. La plage optimale de fluorescence dans lysat dilué est de 400 à 1500 unités de fluorescence.

4. Détermination du ligand Optimal gamme de concentration

1. La plus forte concentration du ligand doit être au moins 20 fois supérieure à la constante de dissociation attendue.
2. La concentration de ligand plus faible doit être inférieure à la concentration molaire de la protéine fluorescente.

Reportez-vous à l'outil de recherche Technologies de concentration NanoTemper pour l'estimation de la gamme de concentration de ligand.

5. Préparation de lysat cellulaire et les dilutions de ligands

1. Placer une grille de tube avec un nombre nécessaire (généralement 10-16) de 0,5 ml tubes à centrifuger de LoBind sur la glace. Pipette 25 ul de tampon MST au fond de chaque tube. Ajouter 25 pl de la solution mère de ligand à la première baignoiree (n ​​° 1, un ligand plus forte concentration) et d'effectuer en série deux fois la dilution du ligand en utilisant le reste des tubes. Gardez le rack avec des échantillons de ligands sur la glace.
2. cellule de dégel lysat lentement sur la glace.
3. Diluer lysat cellulaire avec un tampon MST à fournir le niveau optimal de la protéine cible fluorescente dans les réactions de liaison. Concentration de protéine finale devrait être proche de prévue K _D ou inférieur. Il doit être ajusté pour obtenir le numéro de compte nécessaire de fluorescence dans la solution finale. Pour la détermination de la GFP-STAT3 concentration dans le lysat, l'instrument a été calibré avec une aide de fluorescéine. La concentration molaire de la GFP dans le lysat a été déterminée en utilisant respectivement le rapport de la fluorescéine et EGFP rendements quantiques, 0,85 et 0,61 ^15.

6. Microscale thermophorèse Etudes de liaison

1. Sélectionnez la source d'excitation LED avec λ = 470 nm sur l'instrument MST.
2. Placer les tubes de 0,5 ml LoBind dans la tube porte en face de tubes avec des échantillons de dilution en série de ligands. Ajouter avec précaution 15 pl du lysat de cellules au fond de chaque tube. Essayez de ne pas toucher les parois du tube pour éviter la perte de l'échantillon.
3. Ajouter 15 ml de l'échantillon de ligand avec la plus forte concentration (n ° 1) dans le tube correspondant n ° 1 avec le lysat cellulaire. Mélangez bien et changer une pointe de pipette. Répéter cette étape avec le reste des tubes à l'exception de la dernière, qui doit contenir aucun ligand.
4. Ajouter 15 ul de tampon MST au dernier tube et bien mélanger.
5. Remplir environ 2/3 du premier capillaire avec le mélange de liaison de tubes n ° 1, inclinaison de se déplacer de la solution vers le centre, et de placer le tube capillaire sur le plateau capillaire à la position n ° 1 (la position la plus proche de l'ouverture du bac) . Répétez cette étape avec le reste capillaires. Extrémités capillaires peuvent être branchés à la cire pendant de longues expériences.
6. Placez le bac à l'intérieur de l'instrument MST et fermer la porte de l'appareil.
7. Effectuer "Trouvez capillaires"commande de laisser l'instrument trouver les positions exactes des capillaires et mesurer la fluorescence des échantillons.
8. Sur la base de l'intensité du signal de fluorescence, régler la puissance LED (10-100%) pour le mettre en 400-1,500 unités intervalle.
9. Cliquez sur le bouton "Démarrer" pour réaliser l'expérience de thermophorèse. Plus d'une énergie laser infrarouge peut être choisie pour l'expérience, afin de trouver le gradient de température optimale pour le système particulier. Collecter des données 2-3 pistes pour le même ensemble de capillaires afin d'assurer la reproductibilité des mesures. Il faut 10-12 minutes pour exécuter une série de 16 capillaires.

7. Micro-analyse des données de thermophorèse

1. Ouvrez le logiciel d'analyse.
2. Chargez le dossier du projet. Dans les informations Run Viewer apparu sélectionner collectées à une puissance laser IR spécifiques courbes thermophorétiques. Il ya une option d'ouvrir toutes les traces thermophorétiques recueillies dans diverses conditions telles que la puissance du laser IR, LED peurs, température, concentration, etc. à la fois, puis en choisissant toutes les courbes d'analyse par les allumer et éteindre (cliquez sur le nom de l'expérience).
3. Dans la fenêtre graphique des points d'évaluation, sélectionnez le thermophorèse ou thermophorèse avec T-jump. Veiller à ce que les lignes bleues et rouges sont correctement positionnés. Pour obtenir les points moyens des écarts types, sélectionner "Utiliser moyenne» ou «Distinguer tourne" pour analyses différentes.
4. Pour tracer une forme constante de dissociation, sélectionner "Utiliser moyenne", entrez et fixer la valeur de la concentration en molécule marquée (cochez la case «concentration» dans le menu de la fenêtre en forme), et ajuster la courbe. La valeur K _D avec son écart-type apparaît dans une dénonciation distincte fenêtre pop-up. Pour tracer un ajustement par la méthode Hill, sélectionnez "moyenne", méthode Hill, puis ajuster la courbe. La valeur d'affinité EC ₅₀ avec son écart-type est indiqué dans ce cas. La caractéristique de K _D ou Hill "frontière" peut également être utilisé lorsque la saturationdans un état lié n'est pas atteint.
5. Sauvegarder les données d'ajustement moyens dans un fichier texte et transférer vers Excel.
6. Terrain F _norme (fluorescence normalisée), AF _norme (différence de fluorescence normalisée si différentes expériences sont comparées), ou fraction liée (voir formule ci-dessous) en fonction de la concentration en molécule non marquée (titré).

Fraction liée (fraction de molécules dans un complexe) = (Therm (C) non lié) / (lié non lié), où Therm (C) est thermophorèse mesuré la concentration C, liée est thermophorèse pour l'état non lié (lorsque les molécules sont pas dans un complexe), et lié est thermophorèse pour l'état complètement lié.

Résultats

Mesure de l'affinité de non-phosphorylée protéine STAT3 liaison à oligonucléotides.

Cellules HEK293 exprimant STAT3-GFP ont été utilisés comme source d'marqué par fluorescence STAT3 pour dosage de liaison ADN. lysats cellulaires ont été préparés en utilisant un tampon RIPA (20x10 ⁶ cellules / ml). Pour les études de liaison, les lysats ont été dilués 150x avec MST tampon liaison à l'ADN pour assurer le niveau optimal de la protéine fluo...

Discussion

expression et purification de protéines est une étape laborieuse et coûteuse, ce qui est, cependant, nécessaire pour la détermination de K _D interactions par la méthode la plus couramment utilisée. Application des MST permet d'éviter la purification de protéines ce qui simplifie considérablement l'accélération et la caractérisation quantitative des interactions. Il présente des avantages particulièrement importants dans le cas de difficile à exprimer et purifier des protéines telles q...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent/material	Company	Catalogue Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064