Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Resumen

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Resumen

Caracterización cuantitativa de las interacciones proteína es esencial en prácticamente cualquier campo de las ciencias de la vida, en particular el descubrimiento de fármacos. La mayoría de los métodos actualmente disponibles de determinación de K _D requieren acceso a la proteína de interés, la generación de los cuales puede ser mucho tiempo y es caro purificada. Hemos desarrollado un protocolo que permite la determinación de la afinidad de unión por termoforesis microescala (MST) sin purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El método implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido y lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes. Aplicación del método de STAT3-GFP expresa transitoriamente en células HEK293 permitieron determinar por primera vez la afinidad del factor de transcripción bien estudiado a oligonucleótidos con diferentes secuencias. El protocolo es sencillo y puede tener una variedad de aplicaciones para el estudio de interacciones de proteínas con moléculas pequeñas, péptidos, ADN, ARN, y proteins.

Introducción

Caracterización cuantitativa de la afinidad de las interacciones intermoleculares es importante en muchas áreas de la investigación biomédica. Encuadernación constante de disociación _(KD) es esencial no sólo en el descubrimiento de fármacos, pero también es un parámetro importante en la caracterización de cualquier interacción binaria en cualquier sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para la detección de interacciones proteína-proteína, como la inmunoprecipitación y la levadura híbrido de dos pantallas, no nos informan sobre el grado de tensión son las interacciones, mientras que la afinidad define si existe este complejo particular, en determinadas condiciones in vivo. En el proceso de descubrimiento de fármacos, desarrollo de ensayos de unión es uno de los más necesarios y con frecuencia los pasos que más tiempo consume. Los métodos más utilizados de determinación K _D incluyen la polarización de fluorescencia, tecnología ¹ resonancia de plasmones superficiales (SPR), ² radioligand vinculante, ³ calorimetría de titulación isotérmica, ⁴ equilibrium diálisis (ED), ⁵ de ultrafiltración (UF), ⁵ y ultracentrifugación (UC). ⁶ Todos ellos requieren cantidades importantes de proteína diana purificada. Termoforesis microescala (MST) es un método rápido desarrollo que detecta el movimiento dirigido de las moléculas en un gradiente de temperatura microscópica. Cualquier cambio de la capa de hidratación de biomoléculas resultado en un cambio relativo de movimiento a lo largo del gradiente de temperatura. ⁷ MST se utiliza para determinar las afinidades de unión y se ha aplicado para el estudio de unión a las proteínas marcadas con fluorescencia o ligandos fluorescentes ligando a una proteína diana. ^{8, 9} MST permite la medición de las interacciones directamente en solución sin la necesidad de inmovilización a una superficie (inmovilización libre de la tecnología). Prácticamente, cualquier unión es acompañado por un cambio en la señal de MST, aunque el tamaño del cambio difiere de sistema a sistema de manera significativa. Para la detección de movimiento molécula por MST, que tienen que ser fluorescenciant. Esta limitación importante del método se puede convertir en una ventaja. Si una proteína se expresa como una fusión GFP en cualquier sistema, que será la única molécula fluorescente y por lo tanto puede ser estudiado sin aislamiento a partir del lisado celular o sistema de expresión libre de células. Generación de lisados ​​celulares que permiten las condiciones de unión con artefactos mínimos es el principal desafío. Aquí se describe un protocolo de preparación de lisado celular y experimentar MST que se puede utilizar para muchas proteínas solubles y de membrana.

Proteínas STAT están latentes factores de transcripción citoplasmáticos activados por la fosforilación de tirosina en respuesta a señales extracelulares y están implicadas en muchos procesos biológicos, incluyendo la inmunidad, la hematopoyesis, inflamación, y el desarrollo. ¹⁰ En los mamíferos, la familia STAT consta de STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B, y 6. Todas las estadísticas activadas se sabe que se unen a la misma secuencia de ADN, por lo que llama motivo GAS, IFN-gamma activado secuencia. Sin embargo, la transcriPCIONAL efectos de diferentes STAT son muy diferentes. ¹¹ A pesar de la participación en muchos procesos patológicos y extensos estudios que producen más de 17.000 publicaciones, la K _D de las interacciones STAT con diferentes secuencias de ADN no se han determinado. Sólo afinidad relativa de las diferentes estadísticas con las variantes del motivo GAS se ha caracterizado. ¹¹ Las dificultades en la expresión y purificación de proteínas son los principales obstáculos en la caracterización de la selectividad de unión a ADN estadísticas de la '. Aunque la mayoría de los estudios se han centrado en el papel de la Stats "activados", que se convirtió en sinónimo de factor de transcripción Tyr-fosforilada, el papel de STAT no fosforilada (U-STAT) en la regulación de la transcripción está emergiendo rápidamente. ¹² Sin embargo, estos mecanismos no se entienden bien, y no estaba claro si U-STAT en realidad se unen a ADN o actuar a través de interacciones con otros factores de transcripción. Recientemente hemos demostrado que U-STAT3 puede unirse al ADN secuencialces diferente de motivos de gas con aún mayor afinidad. ¹³ El hallazgo tiene implicaciones importantes para nuestra comprensión de las funciones biológicas de esta importante proteína. Hemos aplicado termoforesis microescala para determinar las afinidades relativas de STAT3 a GAS y oligonucleótido rico en AT de S 100 (Figura 4). Casi idéntico protocolo se ha usado para la determinación de K _D para la unión de un ligando de STAT3 diferente, un inhibidor de lipopéptido. ¹⁴ No se unión a un factor de transcripción relacionado, GFP-STAT1 que se utilizó como control negativo podría ser detectado confirmando de este modo la selectividad de interacción. ¹⁴

Protocolo

1. Preparación de lisado celular

Este protocolo está diseñado para las células adherentes que expresan cualquier proteína GFP-fundido. Se necesita el número de células puede variar desde tan bajo como 10 ⁶ a un máximo de 20 x 10 ⁶ células, dependiendo del nivel de expresión de la proteína. Por ejemplo, lisado de células HEK que sobreexpresan GFP-STAT3 se preparó mediante el tratamiento de las células cultivadas en matraces T75 10 a cerca de 70% de confluencia con 1 ml de tampón de lisis. Sin embargo, este lisado tuvo que ser diluida 150 veces para proporcionar el nivel óptimo de la fluorescencia para el experimento MST. Protocolo de lisis celular depende fuertemente de las propiedades y la localización intracelular de la proteína objeto de la investigación. Si el uso de detergentes no es deseable debido a la inestabilidad de la proteína, la sonicación se describe a continuación, podría ser la mejor opción. Diferentes aditivos se pueden añadir al tampón de lisis para prevenir las reacciones de modificación de proteínas: EDTA impide la fosforilación, vanadato de sodio inhibe la proteína fosfatasas de tirosina, por lofluoruro de sodio es un inhibidor de la Ser / Thr fosfatasas.

1. Prepare el buffer de lisis. Por fáciles de extraer proteínas citoplasmáticas la siguiente composición funciona bien: HCl 25 mM Tris, pH 8,0, y cóctel inhibidor de proteasa diluyeron 100 veces (Sigma-Aldrich P2714, que consta de 2 mM AEBSF, 0,3 mM aprotinina, 130 mM bestatina, 1 mM de EDTA, 14 mM E-64, 1 mM leupeptina). Alternativamente, para las proteínas menos solubles, se puede utilizar tampón RIPA comercial con cóctel de inhibidores de proteasa y detergentes no desnaturalizantes. Mantenga el buffer en hielo.
2. Lavar las células brevemente con helado de PBS con 10 ml de tampón por T75 frasco. Mantener células en hielo durante 5 minutos, o hasta que las células comienzan a desprenderse del matraz. Raspe las células con un raspador de células para separar, si es necesario.
3. Resuspender las células en 10 ml de PBS frío y la transferencia a una ronda de 14 ml tubo de centrífuga de fondo previamente enfriado.
4. Precipitar las células por centrifugación a 400-600 xg a 4 ° C durante 5 min. Combino las células de varios frascos en este punto if necesario.
5. Eliminar PBS sobrenadante y se resuspende el precipitado en 200 l de tampón de lisis enfriado en hielo, la transferencia de la suspensión a un pre enfriado tubo Eppendorf de 1,5 ml.
6. Mantener las células en hielo para minimizar el sobrecalentamiento local. Lyse células con 3 x 10 seg pulsos de ultrasonidos a 30% de la amplitud, con un 2-3 mm punta de pre-enfriado. Mantenga la punta por debajo de la superficie para reducir al mínimo la formación de espuma. Omitir este paso cuando se utiliza un detergente que contiene tampón y se incuba en hielo durante 30 min en lugar.
7. Corregir la solución de lisado para contener la concentración de sal fisiológica (100 mM de NaCl) si es necesario el uso de 5 M de NaCl.
8. Recoger lisados ​​por centrifugación a aproximadamente 26.000 xg a 4 ° C durante 10 min.
9. Determinar la dilución de lisado óptima (como se describe en la sección 3 más adelante) y la cantidad de lisado necesario para una titulación (típicamente alrededor de 300 l de lisado pre-diluido).
10. Dividir en partes alícuotas del lisado y se almacena a temperatura apropiada para la proteína objeto de investigación (-80 ° C, en la mayoría de los casos).

2. Selección y Preparación de Tampón de MST

1. Dado que las interacciones proteína-ligando son dependientes de condiciones de tampón, la composición del tampón MST se elige sobre la base de las propiedades de un sistema en particular. Por lo general, es ventajoso para probar por lo menos dos tampones diferentes.
2. Prepare 2 buffers MST 5x. Hemos tenido buenas experiencias con estas dos composiciones: HEPES (250 mM de HEPES, pH 7,4; 25 mM de MgCl _2, 500 mM de NaCl, 0,25% NP-40) y Tris HCl (250 mM de Tris HCl, pH 7,4, 750 mM de NaCl; 50 mM de MgCl _2; 0,05% de Tween-20). La adición de BSA (5% en la mezcla de unión final) puede ayudar a evitar la adhesión de las proteínas a tubos de plástico y los tubos capilares de vidrio. NaN ₃ (0,5 mM) también se puede incluir para prevenir el crecimiento de microorganismos.

3. Determinación de la dilución óptima Lysate

1. Seleccione la fuente de excitación del LED con la longitud de onda λ = 470 nm en el instrumento MST.
2. Cargar capilares con el cell extracto diluido 2 y 10 veces con tampón MST.
3. Realice la operación de "Búsqueda capilares" en software de control de instrumento MST. El rango óptimo de fluorescencia en lisado diluido es de 400 a 1500 unidades de fluorescencia.

4. Determinación del ligando de intervalo óptimo de concentración

1. La mayor concentración del ligando debe ser de al menos 20x más alta que la constante de disociación esperada.
2. La concentración de ligando más bajo debe ser menor que la concentración molar de la proteína fluorescente.

Consulte la herramienta de Tecnologías Buscador Concentración NanoTemper para la estimación rango de concentración de ligando.

5. Preparación de lisado celular y diluciones de ligandos

1. Coloque un bastidor de tubo con un número necesario (normalmente 10-16) de los tubos de centrífuga LoBind 0,5 ml en hielo. Pipetear 25 l de tampón de MST para la parte inferior de cada tubo. Añadir 25 l de la solución madre de ligando a la primera bañerae (# 1, ligando concentración más alta) y llevar a cabo serie de dilución de dos veces del ligando utilizando el resto de los tubos. Mantenga el estante con muestras de ligandos en el hielo.
2. Thaw lisado celular lentamente en hielo.
3. Diluir lisado celular con tampón MST para proporcionar el nivel óptimo de la proteína diana fluorescente en las reacciones de unión. La concentración final de proteína debe estar cerca de la esperada K _D o inferior. Se deberá ajustar para obtener el número necesario de cuentas de fluorescencia en la solución final. Para la determinación de GFP-STAT3 concentración en el lisado, el instrumento se calibró con una ayuda de fluoresceína. La concentración molar de GFP en el lisado se determinó utilizando la proporción de fluoresceína y rendimientos cuánticos de EGFP, 0,85 y 0,61, respectivamente. ¹⁵

6. Termoforesis microescala Estudios de unión

1. Seleccione la fuente de excitación del LED con λ = 470 nm en el instrumento MST.
2. Coloque los tubos LoBind 0,5 ml en el tUbe bastidor a través de los tubos de muestras con ligando de dilución en serie. Añadir cuidadosamente 15 l de lisado celular a la parte inferior de cada tubo. Trate de no tocar las paredes del tubo para evitar la pérdida de la muestra.
3. Añadir 15 l de la muestra ligando con la concentración más alta (# 1) en el tubo correspondiente # 1 con el lisado celular. Mezclar bien y cambiar una punta de pipeta. Repita este paso con el resto de los tubos a excepción de la última, que debe contener ningún ligando.
4. Añadir 15 l de tampón de MST para el último tubo y mezclar bien.
5. Llenar aproximadamente 2/3 de la primera capilar con la mezcla de unión de tubo n º 1, la inclinación que se mueva la solución hacia el centro, y colocar el capilar en la bandeja capilar a la posición # 1 (la posición más cercana a la abertura de la bandeja) . Repita este paso con el resto capilares. Extremos de los capilares se pueden conectar con cera para los experimentos más largos.
6. Coloque la bandeja en el interior del instrumento MST y cerrar la puerta del aparato.
7. Realice "Buscar capilares"comando para dejar que el instrumento de encontrar posiciones exactas de los capilares y medir la fluorescencia de las muestras.
8. En base a la intensidad de la señal de fluorescencia, ajustar la potencia del LED (10-100%) para ponerla en 400-1,500 unidades de intervalo.
9. Haga clic en el botón "Inicio" para llevar a cabo el experimento termoforesis. Más de una fuente de IR-láser puede ser elegido para el experimento con el fin de encontrar el gradiente de temperatura óptima para el sistema particular. Recopilar datos 2-3 carreras para el mismo conjunto de capilares para asegurar la reproducibilidad de las mediciones. Se tarda 10-12 minutos para ejecutar un conjunto de 16 capilares.

7. Análisis de datos termoforesis Microscale

1. Abra el software de análisis.
2. Cargue la carpeta del proyecto. En el Visor de Run Información aparecido seleccione recogidas en un específicas de infrarrojos láser de potencia curvas termoforético. Hay una opción de abrir todos los rastros termoforético recogidos en diversas condiciones, tales como la potencia del láser IR, LED power, temperatura, concentración, etc. a la vez y luego elegir las curvas de análisis cambiándolas por intervalos (haga clic en el nombre del experimento).
3. En la ventana de gráficos de puntos de evaluación, seleccione la termoforesis o termoforesis con T-salto. Asegúrese de que las líneas azules y rojas están colocadas correctamente. Para obtener los puntos de promedio con desviaciones estándar, seleccione "Usar promedio" o "Distinguir corre" de carreras por separado.
4. Para trazar un ajuste constante de disociación, seleccione "Usar promedio", entrar y fijar el valor de concentración de molécula marcada (marque la "concentración" cuadrada en un menú de la ventana en forma), y el ajuste de la curva. El valor K _D con su desviación estándar aparece en una ventana de información emergente independiente. Para trazar un ajuste mediante el método de Hill y selecciona "Normal", el método de Hill, y luego ajustar la curva. El valor de afinidad CE ₅₀ con su desviación estándar se muestra en este caso. La característica de K o _D Hill "frontera", también se puede utilizar cuando la saturaciónen un estado ligado no se alcanza.
5. Guardar los datos de ajuste promedio en un archivo de texto y transferir a Excel.
6. Parcela F _norma (fluorescencia normalizada), Df _norma (diferencia en la fluorescencia normalizada si se comparan diferentes experimentos), o fracción unida (véase la fórmula a continuación) como una función de la concentración de la molécula no marcado (titulados).

Fracción unida (fracción de las moléculas en un complejo) = (Therm (C)-no unido) / (unida-no unido), donde Therm (C) es termoforesis medido para la concentración de C, no unido es termoforesis para el estado no ligado (cuando las moléculas están no en un complejo), y atado es termoforesis para el estado completamente unido.

Resultados

La medición de la afinidad de los no fosforilados STAT3 proteína de unión a oligonucleótidos.

Células HEK293 que expresan STAT3-GFP se utilizaron como una fuente de la etiqueta fluorescente STAT3 para el ensayo de unión al ADN. Los lisados ​​celulares se prepararon utilizando tampón RIPA (20x10 ⁶ células / ml). Para los estudios de unión, los lisados ​​se diluyeron 150 veces con tampón de unión a ADN MST para proporcionar el nivel óptimo de la pro...

Discusión

Expresión y purificación de proteínas es un paso laborioso y costoso, que es, sin embargo, necesario para la determinación de las interacciones de los K _D por el método más utilizado actualmente. Aplicación del MST permite evitar la purificación de proteínas simplificando y acelerando significativamente caracterización cuantitativa de las interacciones. Presenta ventajas particularmente importantes en el caso de difíciles de expresar y purificar proteínas, como las proteínas de membrana y factore...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent/material	Company	Catalogue Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064