Sperm Rekabet Yeteneği in değerlendirilmesi farklılıklar<em&gt; Drosophila</em

Özet

Arasında Diferansiyel sperm rekabet yeteneği Drosophila erkek çift çiftleşme deneyler ile tespit edilebilir. Bu deneylerin her biri ilgi ve bir referans erkek erkek biri içerir. Döl içinde kolaylıkla tespit işaretleri her erkek tarafından babası bireylerin fraksiyonu çıkarım sağlar.

Özet

Ova Gübreleme conspecific erkekler arasında rekabet cinsel seleksiyon mekanizmalarıyla biri değil, en üst düzeye hayatta kalma ve canlılığı ¹ daha başarılı çiftleşme olay sayısı maksimize çalışan yani seçimidir. Sperm rekabeti kendi sperm zaman ve mekan içinde tesadüfi olduğu aynı kadın ^2, çiftleşme sonrası erkek arasındaki rekabet temsil eder. Bu olgu, bitki ve hayvan ³ birden fazla tür bildirilmiştir. Örneğin, vahşi yakalanmış D. melanogaster kadın genellikle 2-3 erkek ⁴ sperm içerir. Sperm farklı erkek ^2,5 gelen sperm doğrudan rekabet unsuru doğurabilecek sınırlı depolama kapasitesi ile özel organlarda depolanır.

Farklı ilgi erkek (deneysel erkek türleri) sperm rekabet yeteneği karşılaştıran kontrollü çift çiftleşme deneysel ile yapılmıştırlaboratuvar ^6,7 olarak ts. Kısaca, tek bir kadın arka arkaya iki farklı erkek, bir deneysel erkek ve bir çapraz çiftleşme referans erkek maruz kalmaktadır. Aynı çiftleşme düzeni daha sonra bu nedenle ortak bir referans yoluyla sperm rekabet yeteneği dolaylı karşılaştırma kolaylaştıran diğer deneysel erkek türleri ile takip edilmektedir. Deney ve referans erkekler tarafından babası bireylerin kısmını basit bir matematiksel ifadeler ^7,8 kullanarak sperm rekabet yeteneği tahmin sağlar işaretleri kullanılarak tanımlanır. Buna ek olarak, sperm rekabet yeteneği deneysel erkek farklı yeterlilik özelliklerini yansıtıcı olduğu varsayılır arkadaşı (sırasıyla suç ve savunma testi,) ^9, ikinci ya da ilk olmasına bağlı olarak iki farklı senaryolarda tahmin edilebilir.

Burada, kabul görmüş t altında yatan farklı genetik faktörlerin rolü sorgulamak için yardımcı olan bir yaklaşım tarifD. sperm rekabet yeteneği o fenomen melanogaster.

Giriş

Geoff Parker böcekler ve evrimsel etkileri ² sperm rekabet yaygınlığı kaydetti yana, Drosophila ve diğer türlerde çalışmalar büyük bir artış çok farklı düzeylerde bu olay biraz ışık tutmak için çalıştık. Ilgi alanları bazı örnekler doğal nüfus ^9,10, genetik mimarisi ve genetik faktörler ^11-14 altta yatan önemi ve cinsiyetler ^15,16 arasında birlikte evrim sürüş rolünü kendi varyasyon ve diğer detaylar olmuştur. D. melanogaster kadın, özel sperm depolama organların sınırlı kapasitesi, sperm kesesi ve seminal priz ^6,17 bir çift, farklı erkeklerden sperm rekabete katkıda bulunmaktadır. Yaklaşık 1.500 sperm söz konusu organların ^18,19 konaklayabilir kadın ama sadece ~ 500 için çiftleşme sırasında aktarılır. Laboratuar, kontrollü çift çiftleşme deneysel olarakBir referans erkek ve ilgilenilen bir veya daha fazla erkek içeren ments yaygın sperm rekabet yeteneği ^7,8 değerlendirmek için kullanılmıştır.

Sperm rekabet yeteneği toplam soyu üzerinde çift çiftleşme deneylerde deneysel erkek tarafından çocuğu döl oranı olarak tahmin, yani bu deneysel ve referans erkeklerde hem de. Edilir Sperm rekabet yeteneği, iki bileşen ayrı bir deneyde değerlendirilen her biri oluşur. Hücum deneyde, birinci erkek gelen sperm yerinden için deneysel erkek sperm yeteneği, referans erkek yani değerlendirilir. Tersine, savunma deneyde, Deney erkek sperm yeteneği yerinden karşı veya referans erkek sperm dölleme oranı azaltmak için değerlendirilir. Tahlil, savunma ya da suç türüne bağlı olarak, sperm rekabet yeteneği puanları P ₁ ve P _2, sırasıyla ile tahmin edilmektedir. P₁ ve P ₂ 0 ile 1 arasında değerler sadece alabilir. Ara değerler genellikle doğrudan sperm rekabet içeren fizyolojik bir senaryo göstermektedir sperm karıştırma, dolaylı kanıt olarak yorumlanır. Aynı mantığı ardından, uç değerler güçlü diferansiyel sperm rekabet yeteneği delil olarak yorumlanabilir. İlk çalışmalar göstermiştir ki D P ₂ melanogaster ⁷ uzatır iki çiftleşme arasında geçen süre olarak artan 0.8 bitti. Bu aynı deney tasarımı diğer Drosophila türlerinde kullanılmıştır, P ₂ sperm rekabet yeteneği ²⁰ değerlendirmek için çalışmalarda yaygın olarak kullanılan istatistik olmaktan. Çoğu tür için, test edilen suşların p ₂ değerleri 0.6 ²¹ daha yüksektir. Bununla birlikte, farklı erkeklerin sperm arasındaki doğrudan rekabet ilgisiz birçok mekanizma aynı puanları (Tartışma) verebilir.

Dbirinci ya da ikinci erkek tarafından çocuğu istinguishing soyu kolayca tanımlanabilir markerlerin kullanımı ile mümkündür. Erken çalışmalarda, erkeklerin birinin öldürücü dozlarda ışınlanmış edildi, örneğin, X-ışınları gibi ışınlanmış sperm tarafından döllenmiş hemen hemen tüm ova ⁷ yumurtadan için başarısız olduğunu. Daha sonra, göz pigmentasyon veya kanat şeklini değiştiren mutasyonlar en yaygın olarak kullanılan belirteçler olmuştur. Eski örnekleri mutasyonlar BW (kahverengi) ^9, CN (zencefil) ²² ve W (beyaz) ²³ fenotipleri ikinci tip mutasyon Cy (Kıvrımlı) ²⁴ tekabül ederken, bu mutasyonların bazıları birleştirilmiştir Aynı kişi, örneğin cn bw. Daha az ölçüde, allozimler ²⁵ ve bilinen kalıtım desenleri ile Mikrosatellitlerin ^26,27 da kullanılmıştır.

Farklılıkları test etmek için deney tasarımıSperm rekabet yeteneği, Clark ve ark, esasen burada aşağıda açıklandığı. ^9. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar sadece inceleme altında deneysel erkek tiplerinin ayırıcı babalık hakkında bilgi vermek. Ayrıca spor ^14,28 ve sperm görselleştirme teknikleri ²⁴ sonrası döllenme farklılıkları hesaba katmak Tahliller P ₁ farklılıklar (veya P ₂₎ puanları sperm yeterlilik farklılıklar olarak yorumlanabilir sağlar.

Şekil 1 suç ve savunma deneyleri hem de mantığı özetliyor. Sürecin lojistik göstermek için, bir suç deney D. gerçekleştirilen melanogaster ¹⁴ ayrıntılı olarak açıklanacaktır. Bu özel suç test sperm rekabet yeteneği multigen aile Sperm özel dynein ara zinciri (Sdic) ölçülebilir bir etkisi test etmek için kullanılmıştır. Tüm üyeBu multigen ailenin s X kromozomu üzerinde tandem bulunur. Nakavt erkek Sdic küme silerek oluşturulmuştur. Silinen bölümü de temel gen kısa kanat (sw) dahil ve çalışmanın amacı Sdic bir alaka değerlendirmek olduğu için, Sdic-sw silme taşıyan erkek (P {sw} olarak sembolize sw bir transgenik kopyasını tarafından kurtarıldı , ayrıca kromozom 2 bir mini-beyaz muhabiri gen) yapılan hangi. Göz rengi babalık tanımlanması için görünür bir marker olarak kullanılmıştır. Tüm referans sinekler erkek olarak kullanılmıştır suşu Oregon-R, o dışında beyaz bir mutant arka edildi.

Protokol

Küçük ölçekli deneyler tüm prosedürü aşina olmak için yapılmalıdır.

1. Virgin Kadın ve naif Erkekler Toplama

B) Oregon-R bireyler naif referans erkek toplamak amacıyla, c a) w ^1.118 kişi bakire kadın toplamak için: belirtilen deney en basit sürümü yetişkinlerin aşağıdaki kombinasyonu içeren ilk haç dört tip, oluşur ) P {sw} homozigot erkek ve bakire kadın naif deneysel erkek (Tip I) toplamak için Sdic en vahşi tip organizasyon taşıyan bir kontrol hattı ve d) P {sw} homozigot erkek ve Sdic-sw-silme -taşıyan Sdic-sw eksikliği (Tip II) taşıyan saf deneysel erkek toplamak için bakire kadın.

1. 8-10 kadın, 5 erkek her içeren birden fazla şişe ayarlayın. Kadın yatıyordu izin veryumurta ve her 3-5 günde yeni şişelere yetişkin aktarın. Şişe yerine şişeleri gerekirse kullanın ve her zaman taze gıda kullanın. Gerekli şişeleri sayısı üzerinde çalışma yapılan deneysel erkek tiplerinin sayısı ve farklılıklar (Tablo 1) tespit etmek için gerekli olduğu tahmin edilen bireylerin sayısına bağlıdır. Flakon başına 10'dan fazla kadın döl doğurganlık değişim neden olabilir larva büyüme sırasında aşırı kalabalık neden olabilir. 25 ° C'de saklayın şişeleri sıcaklık kontrollü bir odaya C.
2. Ilk haçlar kurduktan sonra gün 11 ^inci ve 12 ^inci bakire kadın ve naif erkek toplamaya başlar. Bekleme süresi sıcaklığına bağlı olarak değişir; düşük sıcaklıklarda sonucu uzun gelişimsel zamanda bireylerin toplama geciktirmek. Eclosion üzere zaman etkileyen bir başka faktör orta türüdür. Bu mısır unu-maya orta ²⁹ gibi besleyici gıda, yetişkin düzgün gelişimi sağlarçiftleşme kolaylaştırır üreme sistemi,. Unmated toplayın her 4-6 saat uçar. Toplarken, şişenin içine _CO2 getirerek sinekler uyutmak, sinekler dokunun ve seks stereomikroskop altında (Şekil 2). Seks ve uygun fenotip ve etiket şişeleri tarafından farklı şişeleri içine istenen sinekler yerleştirin.

Not 1. Koleksiyon rutin atarak önceki gece ortaya çıkan yetişkinler tarafından sabah başlar. Gün boyunca bir veya iki kez bakire kadın ve naif erkek toplayın. Tipik olarak, D. melanogaster erkek 25 ° C ³⁰ eclosion sonra cinsel olgun 8 saat olmak. Sinekler 12:12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında kalırlarsa, eclosion iki tepe bekleniyor: ilk 1-2 saat boyunca ışık söner önce ışığı ve 2 saat boyunca açıldıktan sonra. Eclosion pupa kararır sonra 24 saat içinde ortaya çıkar.

Not 2. En fazla 10 kadın should aşırı kalabalık önlemek için aynı şişenin içine koymak. Bunlardan en az biri bakire olmadığı için bu aynı zamanda atılır olması durumunda kadın kaybını sınırlar.

Not 3. Kısa bir süre içinde bakire kadın ve naif erkek uygun sayıda toplamak için, aşağıdaki önlemleri kabul edilebilir. Deneysel erkeklerin iki tür (Tablo 1) ile ilgili deneyler ¹¹¹⁸ w 15-20 şişeleri ayarlayın. Hafifçe medya yüzeyine serpin ve yumurtlama kolaylaştırmak için birkaç tane kuru aktif maya pelet ekleyin. Gün üst üste anne en az 4 kez aktarın. Anne başka bir flakon (Şekil 3) aktarılır sonra her şişe içinde pupa devresi için uygun olan yüzey artırmak için, ^4. veya ^5. gün boyunca çok katlanmış kağıt (7 x 5 cm) takın. Ilk haçlar ortaya yetişkin sayısına yeterli değilse, bir kaç gün daha bekleyin ve bireysel olmak toplamakflakonlarından als farklı tarihlerde kurdu. Iş yükünü dışarı bile birkaç gün üst üste üzerinde deneyler yürütmek planlıyoruz.

2. Çift çiftleşme Deneyler

Şekil 4 ¹⁴ yapılan çift çiftleşme deneylerinde yer alan ana adımları gösterir.

1. 1. Gün sabahı, ilk çiftleşme kurmak. Oregon-R erkeklerin suç tayininde arkadaşı için ilk olarak.
   1. Aspiratör kullanarak, 10 4-5-günlük-eski beyaz gözlü w ^1.118 bakire kadın ve 10 kırmızı gözlü Oregon-R naif erkek her içeren flakon kurmak. İki üç şişeleri 5 gün boyunca günlük olarak ayarlanır. Ayarlanması için flakon sayısı mevcut bireylerin sayısına bağlı olarak değişebilir. Sinekler 2 saat dostum izin verin.
   2. Oregon-R erkek atın ve bir aspiratör (Şekil 5) kullanarak yeni bir şişenin içine her kadın yerleştirin. Seks kimlik birkaç görsel inceleme ile elde edilebilirmorfolojik farklılıklar (Şekil 2). Uygun her flakon Etiket ve 2 gün (bundan sonra "v1") için flakon kadın bırakın.
2. 3. Gün, ikinci çiftleşme kurmak. Kurmak erkek ve çapraz Seçim deneysel erkek türlerinin herhangi yönelik herhangi bir potansiyel sapma en aza indirmek amacıyla rastgele yapılmalıdır.
   1. Işığı söner iki saat önce, bir aspiratör ile yeni bir şişenin içine tekrar kadın aktarın. Uygun yeni şişe etiket (bundan sonra "v2").
   2. V2 içine aynı genotip üç 5-6-günlük eski deneysel erkek tanıtmak.
   3. Her kadın için 2.2.1 ve 2.2.2 tekrarlayın.
   4. 4. Gün, sağ ışık iki saat önce aspiratör kullanarak (yani 2.2.1 sonra en fazla 12 saat), atın erkek açıktır.
3. Gün 6, yeni bir şişenin içine tekrar her kadın aktarın. Uygun (bundan sonra "v3") yeni şişeleri etiketleyin.
4. Gün 10, w ^1.118 atmak kadın destek.
5. V2 ve v3 yavrularıyla inceleyin. Kadın v2 kadın ilk başlatan ovipositing sonra Günü 17 örneğin v2 (veya v3), içine sonra ilk inceleme 13-15 gün sonra yapılır. Ikinci muayene 17 gün sonra tam olarak gerçekleştirilir. Bu süre aynı flakon ikinci bir nesil garanti güvenli bir üst temporal sınır teşkil etmektedir. Döl sayma sağlaması ve iki denetimler aşırı kalabalık önlemek.
   1. Gün 17, v1 incelemek ve mevcut kırmızı gözlü döl olmadığından emin olmak, buna göre şişe işareti değilse. Hiçbir döl referans ya da deneysel erkek görülmedi ile bu çiftleşme gösterir iken beyaz gözlü döl varlığı kadın ilk çiftleşme sırasında bakire olmadığını gösterir.
   2. Gün 17, v2 ilk muayene gerçekleştirin. Anestezisi CO ₂ ile v2 döl ortaya çıkan ve göz rengi ve cinsiyete göre sıralayabilirsiniz. Ilk ve sn babası Kayıt döl numaralarıond erkek. Şekil 6, her bir birleşme düzeninin döl beklenen fenotipleri gösterir. Bu özel deneyde ^14, sadece kadın döl açıkça referans ya da deneysel erkek tarafından çocuğu ve bu nedenle sadece kızları gelen bilgiler P ₂ hesaplamak için kullanılabilir olarak atanabilir. Diğer işaretleri ile erkek yavru babalık açıkça atanabilir ise, her iki cinsten döl sayıları aşağı hesaplamalarda kullanılabilir. Döl atın ama ikinci muayene için v2 tutun.
   3. Gün 20, v2 yeni ortaya çıkan döl ile 2.5.2 olarak devam ve sonra şişe atın.
   4. Gün 20, ilk kez v3 ortaya döl kontrol ve adım 2.5.2 izleyin.
   5. Gün 23, v3 yeni ortaya çıkan döl ile 2.5.3 olarak devam edin.

Not 1: Birden fazla çiftleşme olabileceğini P puanları üzerindeki potansiyel şişirme etkisi (2.2.2 ve 2.2.3) nedeniyle, çiftleşme, belirli bir zaman çerçevesi ile sınırlı olabilir. Zaman çerçevesi kadın kullanılan erkek genotipi ile ilişkili remating frekansına bağlıdır. Birden fazla çiftleşme olasılığı özel gece ¹¹ sırasında azalır.

Not 2: Bu ergin sinek sayısı düşüktür maya potansiyel büyümesi ile sorunlara neden olabilir, çünkü canlı maya pelet eklemeyin.

3. Veri Analizi

1. Kaydedilen döl sayıları uygun bir istatistik paket (SAS Institute örneğin, JMP) veya ücretsiz web tabanlı araçlar (örneğin kolay görsel denetim ve verimli analizi için uygun düzenlenmelidir http://vassarstats.net/ ).
2. Sperm rekabet yeteneği. V2 ve v3 gelen sayıları ekleyin. Hiç ya da çok sınırlı döl (örneğin <10) yol açmıştır erkek sineklerin, işlem sırasında ölen ya da sadece başarılı insemina vardıiki erkek biri tarafından ted olmayan bilgilendirici olarak kabul edilir ve herhangi bir alt istatistiksel analiz (2.5.1 ve Tablo 2) dışındadır. Her bilgilendirici kadın için P ₂ puan hesaplayın.
3. Karşılaştırıldığında deneysel erkekler arasında P ₂ değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı fark olup olmadığını test edin. Bu parametrik (örneğin Tukey HSD) veya P ₂ değerleri dağılımının çarpıklık ve varyans ve ortalama arasındaki bağımlılık gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak non-parametrik (örneğin Çelik-Dwass) testleri kullanılarak yapılabilir. Açısal dönüşüm genellikle parametrik testi ³¹ kullanım öncesinde örneğin P ₂ oranlarda uygulanır.
4. Çiftleşme kur farkları (isteğe bağlı). Her deneysel erkek tipi için, iki kat evlendirilen kadın ve sadece ilk erkek (suçun tayininde referans erkek ve d deneysel erkek ile evlendirilen olanların sayısını hesaplamakefense tahlili). Bir iki kuyruklu Fisher testi (mevcut kullanarak http://www.langsrud.com/fisher.htm ), deneysel erkeklerin iki tür arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek.
5. Cinsiyet oranı (isteğe bağlı). Her deneysel erkek için, beklenen 1:1 oranında her kadın sapma gelen döl olsun cinsiyet oranı belirlemek için ki-kare testi kullanın.

Sonuçlar

Tablo 2 iki suç deney bazı belirgin özellikleri (Tahliller 1 ve 2) özetlemektedir hangi D. ve (sırasıyla, Tip I ve II) bir fonksiyonel Sdic yığılım melanogaster deneysel erkeklerde ¹⁴ karşılaştırılmıştır. Dikkate bazı çoğaltır karşılaşılan farklı olaylar aldıktan sonra, kadınların 58-83% bilgilendirici ve bu nedenle döl babalık sayıları P ₂ hesaplamak için kullanılabilir olduğu tespit edildi. Parametrik olmayan test so...

Tartışmalar

Biz genetik olarak farklı göreli katkısı farklılıkları değerlendirmek için deneysel tasarım nitelendirdiler D. kontrollü çift çiftleşme deneyler ^7,8 olarak döl için melanogaster erkek. Bu sperm rekabet yeteneği etkilemek için ve benzer bir prosedür savunma testi (Şekil 1) için de geçerlidir rağmen suçun testi içinde gösterildiği olmuştur hipotezi bir genetik faktör bağlamında yapılmıştır. Bu deneysel tasarım gibi kadın genotip ^32'...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber latex tubing	VWR	62996-473	1/4 inch ID, 1/6 inch Wall
1 ml graduated XL filter tips	USA Scientific	1126-7810	Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed
Parafilm	Sigma	P-7793
Mesh Fabric			Thin and smooth
Stereomicroscope	Leica	S6D
CO2 Tank	Airgas	CD-50	Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available
FlyStuff Foot Valve, complete system	Genesee Scientific	59-121C	Not necessary if FlyNap is used
Plastic vials	Genesee Scientific	32-109	Come with carboard trays that can be reused for holding vials
Cotton balls	Fisher Scientific	AS-212
Active dry yeast	Red Star		Found in general grocery store
Sharpie markers			Different colors may be used for marking different genotypes