Den<em&gt; Xenopus</em&gt; Äggcellen Cut-öppen vaselin Gap spänning-clamp teknik med fluorometri

Summary

Snittet-öppna vaselin gapet metod används för att erhålla låga ljudinspelningar av joniska och grind strömmar från spänningsberoende jonkanaler som uttrycks i Xenopus oocyter med hög upplösning på snabba kanal kinetik. Med mindre modifiering, kan spänningen klämma fluorometri kopplas till cut-öppna äggcell protokoll.

Abstract

Snittet-öppna äggcell Vaselin gap (COVG) spänningsklämtekniken möjliggör analys av elektrofysiologiska och kinetiska egenskaper heterologa jonkanaler i oocyter. Inspelningar från cut-öppen inställning är särskilt användbara för att lösa låg magnitud gating strömmar, snabb jonström aktivering och avaktivering. De främsta fördelarna över två-elektrodspänningen klämman (TEVC) teknik är ökad klämhastighet, förbättrat signal-till-brus-förhållande, och förmågan att modulera intracellulära och extracellulära miljön.

Här använder vi den mänskliga hjärtnatriumkanal (HNA _V 1.5), uttryckt i Xenopus oocyter, att demonstrera cut-öppen inställning och protokoll samt ändringar som krävs för att lägga spänning klämma fluorometri förmåga.

Egenskaperna för snabba aktiverande jonkanaler, såsom HNA _V 1.5, inte helt kan lösas nära rumstemperatur med hjälp TEVC, i which helheten av oocyten membranet är fastklämd, vilket gör spänningsreglering svår. Emellertid i cut-öppen teknik, isolering av endast en liten del av cellmembranet möjliggör snabb fastspänning krävs för att korrekt registrera snabb kinetik och samtidigt förhindra kanal neddragning associerad med patch clamp-tekniker.

I samband med COVG teknik jonkanal kinetik och elektrofysiologiska egenskaper kan ytterligare analyseras genom att använda spänningsklämma fluorometri, där proteinet rörelsen spåras via cystein konjugeringen av extracellulärt tillämpade fluoroforer, infogning av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, eller inkorporering av onaturliga aminosyror in i området av intresse ^1. Denna ytterligare uppgifter ger kinetisk information om spänningsberoende konforma omdisponeringar av proteinet via förändringar i mikromiljö som omger den fluorescerande molekylen.

Introduction

Specialiserade spänningsklämtekniker tillåter inspelning av joniska strömmar vid styrda membranpotentialer. Ofta används två elektroder spänning klämma (TEVC) och patch clamp teknik ger tillförlitlig elektro uppgifter om egenskaperna hos många jonkanaler. Men båda dessa metoder har nackdelar som hindrar förvärv av tillförlitliga uppgifter för snabba spänningskänsliga natriumkanaler och andra snabba aktiverande kanaler i membran som de i Xenopus oocyter. De Bezanilla och Stefani laboratorier utvecklades därför cut-öppna vaselin gapet spänningsklämteknik (COVG) för ägg ^2. Tekniken har använts i stor utsträckning för att spela in, Na ^+, K ....

Protocol

1. Initial Installation av utrustning

1. Placera scenen och mikroelektrod manipulator på en vibrationsisolering systemet (t.ex. en luft tabell) med en omgivande Faradays bur för att förhindra elektriska och mekaniska ljud.
2. Löd sex Ag / AgCl pellets till sex-tums längder av 24 AWG-kabel. För en av dessa längder (som skall anslutas till P1), skarv i en andra tråd för att bilda en "Y". På ändarna av varje tråd löda ett guld BNC stift, som ingår med förstärkaren.

Discussion

Snittet-öppna äggcell vaselin gapet spänningsklämteknik möjliggör snabb upplösning av data, låg ljudnivå, ökad kontroll över intern lösning och extern lösning sammansättning, och stabila inspelningar under relativt långa protokoll ^19. Dessa fördelar ställa denna teknik bortsett från den standard två-elektrodspänningsklämma och patch clamp-tekniker. Även om specialutrustning som krävs och protokollet är relativt svårt, mycket få problem uppstår när systemet har optimerats. Detta mö.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Solution	Brand	Catalog Number	[Final], weight, or volume
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	25mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	90mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Calcium hydroxide	Sigma-Aldrich	239232	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Internal Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	105mM
MES Sodium Salt	Sigma-Aldrich	M5057	10mM
HEPES	Research Products International	H75030	20mM
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	2mM
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Depolarizing Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	110mM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	1.5mM
Calcium Chloride	Caisson	C021	0.8mM
HEPES	Research Products International	H75030	10mM
Pipet Solution
KCl	Sigma-Aldrich	221473	3M
Saponin Solution
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	0.125g
Internal Solution	See above		50mL
Agar Bridge Solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	100ml of 1M
HEPES	Research Products International	H75030	1.2g
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M8250	variable (pH to 7.4)
Granulated Agar	Research Products International	A20250	3%
NMDG Storage Solution
NMDG, HEPES, MES Hydrate solution	see above		40ml
Water			60ml
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Performance Oocyte Clamp	Dagan	CA-1B
Data Acquisition System	Axon CNS	Digidata 1440A
Oscilloscope	Tektronix	TDS 210
Rack Power Filter	APC	G5
Heating/Cooling Bath Temperature Controller	Dagan	HCC-100A
PC	Dell	Optiplex 990
pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software	Molecular Devices, LLC	pCLAMP10.3
TMC Vibration Control TableTop Platform	TMC	64 SERIES
TMC Vibration Control Air Table	TMC	20 Series
V1/I Electrode Data Collector	Dagan	part of CA-1B
MX10L Micromanipulator	Siskiyou	MX10L
Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors)	Dagan	part of CA-1B
Microscope	Omano	OM2300S-JW11
Temperature Control Bath	Custom or Dagan	Custom or HE-204C	Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C).
Custom AgCl Pellet Container	Custom	Custom	Custom machined
Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm	Warner	E-206
External Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-1-T-LB	Custom machined or purchased from Dagan
Internal Oocyte Bath	Custom or Dagan	Custom or CC-TG-ND	Custom machined or purchased from Dagan
Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes	Warner	G150T-4
Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath	Siskiyou	SD-1280P
Fiber-Lite	Dolan-Jenner	LMI-600
Regular Bleach	Clorox	470174-764
Xenopus laevis Oocytes	Nasco	LM535M (sexually mature females)
90 Na+ External Solution	See Solutions sheet
10 Na+ Internal Solution	See Solutions sheet
3 M KCL	See Solutions sheet
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
NMDG Storage Solution	See Solutions sheet
5mL transfer pipets	SciMart	GS-52
Modified KCl electrode injector	BD	309659	Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased.
Microvaccum	Custom	Custom
Forceps	VWR	63040-458
Oocyte Handling Tools (Pipette Pump)	VWR	53502-222
Deionized Water Squirt Bottle	VWR	16649-911
Vaseline Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086-291
Additional Materials Required for VCF Recordings:
VCF Microscope	Nikon	Eclipse FN1
Nikon CFI APO 40XW NIR Objective	Nikon	N40X-NIR
X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes	Sutter Instruments	MT500-586
External VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm.
Internal VCF Oocyte Bath	Custom		Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm.
Modified Temperature Control Bath	Custom		Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber.