Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Zusammenfassung

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Zusammenfassung

Obwohl von kurzer Dauer ist Mitose ein komplexes und dynamisches mehrstufiges Verfahren grundlegend für die Entwicklung der Organe, einschließlich des Gehirns. In der sich entwickelnden Großhirnrinde kann abnorme Mitose von neuronalen Vorläuferzellen Defekte in der Gehirngröße und Funktion führen. Daher besteht ein kritischer Bedarf an Werkzeugen, die Mechanismen der neuralen Vorläufer Mitose verstehen. Kortikale Entwicklung in Nagetieren ist eine herausragende Modell für die Untersuchung dieses Prozesses. Neurale Vorläufer Mitose wird häufig in festen Hirnschnitten untersucht. Dieses Protokoll wird im Detail beschreiben einen Ansatz für die Live-Darstellung der Mitose in ex vivo embryonalen Hirnschnitten. Wir werden die wichtigsten Schritte für dieses Verfahren zu beschreiben, welche sind: Gehirn-Extraktion, Gehirn Einbettung Vibratom Schnitte von Hirnschnitten, Färbung und Kultivierung von Scheiben und Zeitraffer-Bildgebung. Wir werden dann zeigen und beschreiben im Detail, wie der nach dem Erwerb der Mitose Analyse durchzuführen. Wir sind repräsentative Ergebnisse from dieser Test mit dem Vitalfarbstoff Syto11 transgene Mäuse (Histon H2B-EGFP und Centrin-EGFP) und in utero Elektroporation (mCherry-α-Tubulin). Wir werden diskutieren, wie dieses Verfahren am besten optimiert werden kann und wie sie für die Untersuchung der genetischen Regulation der Mitose geändert werden. Live-Imaging der Mitose in Hirnschnitten ist ein flexibler Ansatz zur Bewertung der Auswirkungen von Alter, Anatomie, und genetische Störung in einer kontrollierten Umgebung, und eine große Menge von Daten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu erzeugen. Daher dieses Protokoll wird die bestehenden Werkzeuge für die Analyse von neuronalen Vorläufer Mitose ergänzen.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie die Live-Darstellung von neuronalen Vorläufer Mitose in der embryonalen Hirnschnitten durchzuführen. Mit Live-Bildgebung von Hirnschnitten in Kultur, bietet das Protokoll eine einfache Methode, um mehrere Aspekte der Mitose in neuralen Vorläuferzellen in einem Umfeld sehr ähnlich zu einem in-vivo-Einstellung testen. Es kann an Gehirnen von mutierten Tieren und / oder Gehirn, die mit in utero Elektroporation ^1-5 manipuliert wurden) angewendet werden. Diese Technik eignet sich auch hervorragend, um die Wirkung von pharmakologischen Mitteln auf neuralen Vorläufer 'Mitose zu testen, durch einfaches Hinzufügen eines Mittels zu dem Kulturmedium. In der Summe wird dieser Artikel machen eine technisch anspruchsvolle Protokoll zugänglich, die das Studium der Neurogenese.

Während der Neurogenese, unterschiedliche neuronale Vorläuferpopulationen unterziehen präzise Divisionen zu Neuronen, die schließlich zu den sechs kortikalen Schichten der erwachsenen Neocortex ^08.06 beitragen erzeugen. Früh in kortikalen Entwicklung, dehnt sich die neuralen Vorläuferpool neuroepithelialen (NE) Zellen teilen sich symmetrisch zur Selbsterneuerung. NE Zellen wandeln dann in radiale Gliazellen (RGZ). Zunächst RGZ symmetrisch teilen, um zwei neue RGZ produzieren, jedoch während der Großteil der Neurogenese, ist Haupt-Modus der Aufteilung RGZ 'asymmetrisch. Bei der asymmetrischen Teilung, gibt ein RGC zu einer neuen RGC und entweder mit einem post-mitotischen Neuronen oder eine spezialisierte Vorläufer (entweder eine kurze neurale Vorläufer (SNP), einem äußeren radialen Gliazellen (ORG) oder einem Zwischenvorläufer (INP) ^2,3,7,9. INPS, SNPs und ORGs können dann erzeugen Neuronen an der Unter ventrikuläre, ventrikuläre und basalen Regionen des Kortex. Daher ist jeweils Zellteilung der Vorläuferzellen eine grundlegende Verfahren zur Erzeugung von Neuronen des Neocortex.

Zahlreiche Studien weisen auf eine Korrelation zwischen der spezifischen Merkmale der mitotischen RGZ und das Schicksal der Tochterzellen. Haydar et al. Und Takahashi et al.haben gezeigt, dass die Dauer und RGC mitotischen Zellzyklus Anstieg der Neurogenese als Erlös, hallte eine Feststellung, in Folgestudien ^10-13. Eine Reihe von Studien haben vorgeschlagen, dass mitotischen Spindel-Orientierung bezüglich des Ventrikels beeinflusst Aspekte der Neurogenese und Kortikogenese, einschließlich Arten von Neuronen erzeugt und Lage der Nachkommen im Gehirn, jeweils ^3,10,14-16. Ob Spaltebene Orientierung Zelle Schicksal direkt beeinflusst, ist umstritten, aber die Schlussfolgerung bleibt, dass diese Parameter mitotische Auswirkungen der Neurogenese. Weitere unterstreicht die Bedeutung der Mitose ist die Beobachtung, dass viele Gene, die in der Mechanik der Mitose beteiligt sind entscheidend für die Neurogenese und für die richtige Entwicklung des Gehirns ^17-20.

Mitose ist ein dynamischer Prozess, aber bis heute die meisten Studien Detaillierung neuralen Vorläufer Mitose nutzen Analyse der Gewebeschnitten oder Bildgebung von neuralen Vorläuferzellen durch in vitro-Zellkultur. So sind die Mainstream-Methoden, um beurteilen zu können Mitose nur eine Momentaufnahme dieses Prozesses und nicht zu entdecken, wie Zellen verhalten sich in einem Gewebe. Live-Darstellung von neuralen Vorläufer Mitose ist zunehmend ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der neuralen Vorläuferfunktion geworden. Beispiele finden Sie diese Verweise ^{4,8,10,21-25.} Mehrere hervorragende Protokolle für die Vorbereitung und Bildgebung von Hirnschnitten ^26,27 erschienen. Doch bis heute hat ein umfassendes Protokoll für Abbildung und Analyse der Mitose nicht beschrieben worden, noch im Video demonstriert.

Diese Technik bietet einige wesentliche Vorteile gegenüber Fest Analyse von Hirnschnitten. Zeitraffer-Analyse von Hirnschnitten ermöglicht die Erzeugung von deutlich mehr Datenpunkte, die in einer flexiblen Weise analysiert werden kann. Zuerst werden die Daten an den einzelnen Zeitpunkten im Verlauf von mehreren Minuten oder mehreren Stunden gesammelt. Man kann einzelne Zeitpunkte (eine statische Montage erstellen) oder analysierenkann zu verschiedenen Zeitpunkten in Filmen zu kombinieren. Zweite konfokale Bildgebung von Scheiben ermöglicht die Erzeugung von Daten mit unterschiedlichen Abschnitten in Z Hirnschnitten. Als Ergebnis können die einzelnen Abschnitte analysiert werden. Alternativ können Stapel von einzelnen Abschnitte in eine maximale Intensitätsprojektion kombiniert werden. Drittens wird die Analyse im Rahmen eines Gewebes durchgeführt, offenbart, wie Zellteilung relativ zu benachbarten Zellen und Strukturen. Viertens ist es ideal um die Analyse von Mutanten, die einige Hinweise von mitotischen Defekte zeigen geeignet. Gemeinsam dieses Protokoll wird zur Klärung kritischen Schritte, um Ermittler, die für die Durchführung von Live-Bildgebung neuronaler Vorläufer Mitose in den eigenen Labors wollen helfen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Medien (Abb. 1, Schritt 1)

1. Slice-Kultur-Medium
   1. 25 ml Kulturmedium Scheibe ist ausreichend, um 5 Glasbodenschalen mit 2 Scheiben pro gut vorbereiten.
   2. In einem 50 ml konischen Röhrchen, fügen 250 ul einer 100fach N2-Lösung und 500 ul einer 50x-Lösung B27 ohne Vitamin A. In DMEM/F12 auf ein Volumen von 22,5 ml.
   3. Filter-Lösung zu sterilisieren und anschließend hinzufügen, 1,25 ml hitzeinaktiviertem Pferdeserum und 1,25 ml fetales Rinderserum.
   4. Inkubieren Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C für die Dauer der Herstellung der Scheiben.
   5. In Wachstumsfaktoren (FGF und EGF, Endkonzentration von 10 ng / ml und 20 ng / ml) unmittelbar vor dem Beginn der Kultur. Die Zusammensetzung dieses Mediums wurde optimiert, um das Überleben von Zellen in Kultur zu fördern und die Proliferationsrate von neuralen Vorläuferzellen zu erhöhen. Dies wird dadurch die Wahrscheinlichkeit zu maximieren,beobachten mitotischen Zellen in der Scheibe.
2. Voll HBSS Dissection Lösung
   1. Planen 500 ml Voll HBSS durch Zugabe von 50 ml 10x HBSS, 1,25 ml 1 M Hepes (pH 7,4, 2,5 mM FC), 6 ml 2,5 M D-Glucose (30 mM FC), 2,2 ml 0,9 M NaHCO ₃ (FC 4 mM) und autoklaviert diH ₂ O auf ein Endvolumen von 500 ml.
   2. Filter-Lösung zu sterilisieren und bei 4 ° C, bis die Sammlung von Uterushörner von der schwangeren Maus. Diese Lösung kann bei 4 ° C über Wochen aufbewahrt.
   3. Halten HBSS auf Eis während der gesamten Dissektion Verfahren.
3. Einbetten Lösung
   1. Für die Einbindung von 4 embryonalen Gehirn, bereiten 30 ml 3% niedrig schmelzender Agarose in der Voll HBSS-Lösung. In einem 50 ml konischen Röhrchen, Hinzufügen von 0,9 g niedrig schmelzender Agarose und Voll HBSS auf 30 ml auf.
   2. Mische die Lösung mit einem Vortex-Mischer und Schmelz in der Mikrowelle mit der Röhre stehen und die Kappe geöffnet ist.
   3. Während in der Mikrowelle, überwachen die Lösung prevent Lauf durch übermäßige Kochen. Beim Kochen beginnt, stoppen Sie die Mikrowelle und verwirbeln die Lösung.
   4. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle die Agarose geschmolzen ist.
   5. Speichert das Röhrchen in ein Wasserbad bei 42 ° C.

2. Präparation der Embryonen (Abb. 1, Schritt 2)

1. Nach sorgfältiger Euthanasie der schwangeren Maus, sammeln die Gebärmutterhörner und übertragen Sie sie in eine 10 cm ² Petrischale mit Kaltvoll 1x HBSS. Das Alter des Embryos kann abhängig von der Studie variieren. Dieses Protokoll wurde erfolgreich zur Kultivierung von embryonalen Hirnschnitten Tage E12.5 bis E17.5 eingesetzt. Aufgrund ihrer Größe, in der Regel jünger Gehirn schwieriger zu sein, mit zu arbeiten.
2. Sammeln Sie die Embryonen und embryonalen sezieren die Gehirne wie zuvor in der Ratte und Maus ^26,27 beschrieben, bis eine vollständige embryonalen Gehirn einschließlich der Hinterhirn und Vorderhirn mit den beiden Gehirnhälften erreicht. Diese könnenbei RT gehalten, bis alle Gehirne wurden seziert.
3. Sammeln Sie die Embryonen und embryonalen sezieren die Gehirne wie zuvor in der Ratte und Maus ^26,27 beschrieben, bis eine vollständige embryonalen Gehirn einschließlich der Hinterhirn und Vorderhirn mit den beiden Gehirnhälften erreicht. Diese können bei RT gehalten werden, bis alle Gehirne wurden seziert.

3. Einbetten der embryonalen Gehirne (Abb. 1, Schritt 3)

1. In einen Eimer mit Eis, erstellen Sie ein Loch im Eis, um die Einbettung in die Formen legen.
2. Gießen Sie den 3% igen Medium in eine Kunststoffform und legen Sie diese Form in das Loch im Eis vorbereitet.
3. Rühre das Agarose-Medium, das mit der Spitze eines digitalen Thermometers, bis die Temperatur 35 º C erreicht,
4. Das Gehirn in dem Einbettungsmittel umgehend zu übertragen.
5. Critical Schritt: So entfernen Sie das überschüssige HBSS an der Schnittstelle zwischen dem Gehirn und dem Agarose, vorsichtig und sanft Wäschetrockner / drehen das Gehirn immer wiederin der Einbettungslösung mit der Zange.
6. Ein Kissen aus gelierten Agarose wird am Boden der Form in Kontakt mit dem Eis bilden. Sobald das Kissen mit der Spitze der Zange unter Rühren des Gehirns zu spüren, positionieren das Gehirn mit der Rückenseite nach oben. Das Gehirn sollte nicht bis auf den Grund der Form sinken.

4. Herstellung von Agarose-Block (Abb. 1, Schritt 4)

1. Lassen Sie die Agarose aushärten im Eis für mindestens 5 min.
2. Verwendung einer Rasierklinge, Abschnitt die Ecken der Form.
3. Eine Agarose-Block schnitzen vorsichtig um das Gehirn mit einer Rasierklinge. Versuchen Sie, die Anzahl der Schnitte zu minimieren, um zu vermeiden, stören die eingebettete Gehirn.
4. Um sicherzustellen, dass der Block eine größere Fläche in der Schwanzregion des Gehirns (gegenüber dem rostralen Bereich, siehe Abb. 1, Schritt 4), um die Stabilität des Blocks auf der Schnitt Sockel zu erhöhen.
5. Der letzte Schnitt sollte das auf der kaudalen Seite des Gehirns;dieser Schnitt die richtige Schnittebene mit der Vibratom definieren.
6. Dies geschieht durch Ausrichten der Klinge senkrecht zur rostro-kaudal-Achse des Gehirns und der Agarose-Block. Schieben Sie die Klinge kaudal entlang der rostro-caudale Achse und die endgültige Schnitt etwa 5 mm von der am weitesten kaudal Region des Gehirns.
7. Stellen Sie die Agarose / Gehirn Block beiseite und wiederholen Einbettung von anderen Gehirnen.

5. Übertragung der Embedded Brains in das Fach des Vibratom (Abb. 1, Schritt 5)

1. Fügen Sie einen Tropfen Kleber auf der Unterseite des Vibratom Fach. Klebt, so daß die Agarose-Blöcke innerhalb der Reichweite des vibrierenden Klinge positioniert werden.
2. Platzieren der Agarose / Gehirn Block Schwanzseite nach unten auf den Rand des Spatels, mit etwa 50% des Block Kippen über den Rand des Spatels.
3. Tragen Sie die Schwanz Gesicht der Agarose-Block zum Leim und schieben Sie den Spatel entfernt, die Aufrechterhaltung der Agarose-Block an den Boden der Schale mit dem shoulder einer Pinzette. Lassen Sie sich nicht die Spachtel direkt an den Leim.
4. Der Klebstoff erstarren lassen bei Raumtemperatur für 5 min.

6. Schnitte der Embedded Brains (Abbildung 1, Schritt 6)

1. Füllen Sie den Vibratoms Tablett mit HBSS.
2. Definieren Sie die Start-und Zielpositionen der Vibratom Klinge.
3. Generieren 200-250 um Scheiben schneiden. Mit der VT1000S Vibratom, verwenden Sie die folgenden Parameter: Geschwindigkeit 2 - 4, 8 Frequenz.
4. Die Scheiben vorsichtig aus dem Vibratom wie sie geschnitten werden. Übertragen Sie die Scheiben mit einem Spatel und dem hinteren Ende der Pinzette in 12-Well-Platten mit voller HBSS gefüllt. Alternativ haben einige Forscher einen Pinsel statt der Pinzette verwendet Schlüsselpunkt:. Während der Übertragung darauf achten, dass die Hirnschnitten bleiben, um die umgebende Agarose angebracht.

7. Syto11 Färbung der Scheiben (Abbildung 1, Schritt 7)

1. Verdünnen Syto11 bis zu einer Endkonzentration von0,5 bis 1 &mgr; m in der Schnittkultur-Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt.
2. In die Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen inkubieren Scheiben von einem Gehirn in 2,5 ml der Färbungslösung für 1 h bei 37 ° C.
3. In 2,5 ml Kulturmedium Scheibe waschen die Scheiben ohne Färbung Lösung für 20 min.

8. Montage der Scheiben in einem Glasbodenschale (Bild 1, Stufen 8, 9)

1. Bereiten Sie 15 ul Einbettung Kollagenlösung pro Scheibe. Vorbereitung einer 1,5 mg / ml Kollagenlösung durch Vermischen von 375 ul 3 mg / ml Kollagen Typ I-Lösung mit 75 ul 10x DMEM, 9,4 ul 1 M NaOH und 290 &mgr; l H ₂ O. Lagern auf Eis.
2. Legen Sie eine 15 ul Tropfen der Kollagenlösung an der Unterseite einer 35 mm Glasbodenvertiefungen Dish. Verteilen Sie es mit einer Pipettenspitze, um die Größe der Scheibe passen.
3. Übertragen Sie die Scheibe in der Drop von Kollagen mit einem Spatel und Pinzette Schlüsselpunkt:. Montage mehrerer Scheiben in verschiedenent Gerichte die Wahrscheinlichkeit erhöht, um Scheiben geeignet für die Bildgebung zu erwerben. Bildschirm durch verschiedene Scheiben und wählen Sie diejenigen, die die unten im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschriebenen Kriterien am besten erfüllen.
4. Lassen die Scheiben Inkubation bei RT für 10 min vor der Übertragung in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO _2.
5. Nach 20 Minuten, fügen Sie 1,2 ml Stück Kulturmedium in die Glasbodenvertiefungen Dish. In 600 ul Medium zu einer Zeit und verbreiten es mit einer Pipettenspitze.
6. Nehmen Sie ein Bild mit geringer Vergrößerung der Hirnschnitt, um die anatomischen Ebene und Integrität der Scheibe aufzuzeichnen.

9. Live-Imaging der Scheiben (Abbildung 1, Stufen 10, 11)

1. Lassen Sie die Scheiben wieder in den Brutschrank für mindestens 1 h und 30 min bei 37 ° C mit 5% CO ₂ vor der Live-Bildgebung.
2. Bild die Scheiben mit dem Mikroskop der Wahl, wenn man bedenkt, dass Syto11 ist sehr anfällig für Photobleaching. Hier ein Wechselrichterted Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop verwendet wird (Andor XD Revolution Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop). Alternativ kann ein konfokaler Laser-Scanning-Mikroskop verwendet werden. Die folgenden Parameter sind für den Spinning-Disk-Mikroskop Set-up.
3. Während des gesamten Live-Bildgebungssitzung beibehalten Scheiben bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Brutschrank mit dem Mikroskop angebracht ist.
4. Bildzellen mit einem Silikonöl 60X Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 300 &mgr; m und einer numerischen Apertur von 1,3 (Beispiele siehe Figuren 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Ein 100X Öl-Objektivs mit einem Arbeitsabstand von 130 &mgr; m und einer numerischen Apertur von 1,4 (z. B. siehe Fig. 4C) können ebenfalls verwendet werden. Die Auflösung der Kamera beträgt 512 x 512.
5. Bild die Zellen in einer 30 um Z-Stapel, mit der Mitte der z-Stapels ungefähr 40 &mgr; m unter der Oberfläche der Scheibe entfernt. Versucht, Bild tiefer in das Gewebe kann zu der Ziel hinzufügenmechanischen Druck auf die Scheibe. Dies kann die Integrität der Gehirnschnitt beeinflussen. Wenn die Planung, 3D-Rekonstruktionen der Zellen zu machen, verwenden Sie einen z-Intervall von nicht mehr als 2 um.
6. Stellen Sie die Laserleistung und Belichtungszeiten, um Ausbleichen zu begrenzen. Eine Belichtungszeiten im Bereich von 30 bis 200 ms, abhängig von der Intensität des Signals Syto11.
7. Mit einem motorisierten Tisch, Bild mehrere Positionen über mehrere Scheiben montiert in ein Gericht. Zum Beispiel, Bild bis zu 20 Positionen über 4 verschiedene Scheiben in ein einziges Gericht gestreut.
8. Für Live-Aufnahmen, mit einem zeitlichen Auflösung von weniger als 5 min, um die Identifizierung der verschiedenen Phasen der Mitose zu ermöglichen. Verwendung Syto11 und / oder Histon-H2B-EGFP, 4 - 5 h Frischabbildungs ​​sind ausreichend, um eine signifikante Anzahl von mitotischen Zellen zu beobachten. Wenn jedoch Abbildungs ​​mitotischen Zellen (wie durch Elektroporation in utero) dünn markiert, dann wird eine längere Bildgebungsparameter (über Nacht) ist angebracht und arbeitet manll.
   Hinweis: Die Verwendung dieses Protokoll beobachten wir in der Regel durchschnittlich 10 mitotischen Zellen pro Position. Wie oben erwähnt, montiert Abbildungs ​​mehrere Schichten steigt die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Experiment. Mit diesem Ansatz, den wir in der Regel identifizieren mitotischen Zellen in nahezu allen Experimenten mit Syto11 oder Histon H2B-EGFP durchgeführt.

10. Post-Akquisition Analyse der Mitose (Abbildung 2)

Alle in diesem Abschnitt sind in Fidschi (ImageJ), was von Vorteil ist, weil es ist ein freies Open-Source-Software optimiert. Andere Software-Lösungen zur Verfügung, um die gleichen Aufgaben, wie Metamorph, Imaris und Amira durchzuführen.

1. Identifizierung der mitotischen Figuren in Fidschi
   1. Nach dem Öffnen der Datenmenge für eine Position als "Hyperstack", wählen Sie eine z-Ebene (siehe Abbildung 2A für den Standort der Bildlaufleiste), wo das Gewebe und Zellen gesund aussehen (siehe Kriterien in der Diskussion Abschnitt).Blättern Sie in der zeitlichen Dimension, Zellen gehen durch Anaphase identifizieren, da es die einfachste mitotischen Phase zu identifizieren.
   2. Blättern Sie in der Zeit zurück, um den Zeitpunkt, zu dem die Zelle die Mitose (DNA Kondensation) tritt zu identifizieren. Die Zelle kann in z-Ebenen zu bewegen, aber die zeitliche Auflösung und die zuvor beschriebenen Z-Stapel-Parameter wurden optimiert, um diesen Prozess zu ermöglichen.
   3. In einer Tabellenkalkulation, so ist der 4D-Koordinaten der Zelle in der Hyperstack (X, Y, Z und Zeit, siehe 2A, um die Lage der Figuren in der Fidschi-Schnittstelle visualisieren), wie es die Mitose eintritt. Die Kenntnis dieser Koordinaten wird das Zählen der gleichen Zelle mehrmals zu verhindern.
   4. Blättern Sie in der Zeit vorwärts und notieren Sie die Zeit, wenn die Zelle entwickelt sich von einer Phase zur anderen. Dokumentieren Sie die Dauer der einzelnen mitotischen Phase für eine bestimmte Zelle.
   5. Gehen Sie mit anderen Zellen, über die gesamte Datenmenge (mehrere Zellen innerhalb und zwischen den Positionen).
2. 3D-RekonstruktionsIonen-Zellen und der Quantifizierung der Rotation während der Metaphase (von Haydar et al, 2003 angepasst) (2B).
   1. Nachdem mehrere mitotische Zellen identifiziert, verwenden Sie die Koordinaten einer Zelle und blättern Sie vorwärts in der Zeit bis zum Beginn der Metaphase.
   2. Drehen Sie den gesamten "Hyperstack", so dass die ventrikuläre Grenze ist eben (mit der "Bild / Transformieren / Drehen ..."-Befehl). Mit der "Winkel"-Werkzeug, um den Winkel zu bestimmen, um für diese Rotation anzuwenden.
   3. Identifizieren Sie die z-Ebene, wo die Zelle von Interesse ist die am meisten sichtbar. In dieser Ebene, benutzen Sie die "Rechteck-Auswahl"-Werkzeug, um eine Auswahl, die die ganze Zelle ziehen.
   4. Identifizieren Sie die z-Ebenen, die die Zelle in der Nähe sind. Verwenden Sie die "Bild / Duplizieren"-Befehl, um eine "Teilstapel" erstellen. Im Dialogfeld verlassen "Duplicate Hyperstack" überprüft. Die "Scheiben (z)" Parameter entspricht der z-Ebenen einschließlich der gesamten cell, und die "Frames (t)" Parameter entspricht dem aktuellen Zeitpunkt.
   5. Wenn die Auflösung ist schlecht, erhöhen Sie die Größe der mit der "Bild / Anpassen / Größe ..." Befehl "Teilstapel".
   6. Erzeugen Sie eine 3D-Rekonstruktion der Zelle an der aktuellen Zeitpunkt mit dem "Image/Stacks/3D Projekt ..."-Befehl. Die Parameter für diesen Befehl sind in Abbildung 2B dargestellt. Die "Scheibe Abstand" entspricht dem Intervall zwischen jedem der z-Ebene Bilder (um). Wichtig: Achten Sie darauf, dass die physische Dimension (um) der Teilstapel wurde konserviert. Wenn nicht, wird die Interpolation der Pixel in der z-Dimension korrekt sein, und die 3D-Rekonstruktion wird ungenau sein.
   7. Mit der Bildlaufleiste, drehen Sie das resultierende 3D-Rekonstruktion, so dass der Rand des Metaphaseplatte sichtbar ist. Die Anzahl der dem Rahmen entspricht, der in Fig. 3B beschrieben beta Winkel, diese Nummer. Mitder "Winkel"-Tool und die "Analyse / Messen ..."-Befehl, messen den Winkel zwischen der horizontalen und einer Linie halbiert die Metaphaseplatte senkrecht (Abbildung 2B). Dies ist der Winkel alpha.
   8. Aufzeichnen diese Winkel für alle Metaphase Zeitpunkte der Zelle von Interesse. Der Drehwinkel zwischen den Zeitpunkten (t) und (t-1) gleich dem Absolutwert der Differenz zwischen einem Winkel an (t) und dieser Winkel bei (t-1).
3. Die Messung der Ausrichtung von der Spaltebene
   1. 3D zu einem Zeitpunkt während der Anaphase rekonstruieren eine Zelle von Interesse nach den für die 3D-Rekonstruktion der Metaphaseplatten beschriebenen Anweisungen.
   2. Drehen die Rekonstruktion, bis die Ränder der beiden Platten durch Trennung der Chromosomen gebildet sichtbar sind.
   3. Verwenden Sie den Winkel Werkzeug, um den Winkel zwischen der Horizontalen (die ventrikuläre Rand) und einer Linie, die parallel zu den beiden Platten durch die Trennung Chromosomen gebildet messen. Dies ist der Winkel der Spaltebene (Fig. 2C).
4. Generierung von Movies
   1. Da die Zellen bewegen sich oft in verschiedenen Z-Ebenen, identifizieren die z-Ebenen, die von der Zelle während der Live-Imaging-Sitzung belegt. Generieren Sie ein "Maximum Intensity Projection" dieser z-Ebenen mit der "Bild / Stacks / Z-Projekt ..."-Befehl. Speichern Sie die Stapel als Datei ". TIF".
   2. Öffnen Sie diese Datei in der Version 1.45 von ImageJ Fidschi beinhaltet nicht eine stabile Plugin für die Generation der ". Mov" oder ". Avi"-Dateien.
   3. Verwenden Sie die "Datei / Speichern unter / ..."-Befehl von ImageJ, um einen Film in einem Format mit der Down-Stream-Anwendungen kompatibel zu generieren.

Ergebnisse

Der Erfolg dieses Tests und die Beobachtung von mehreren mitotischen Zellen während einer Live-Imaging-Sitzung weitgehend abhängig sowohl von der Integrität und der anatomischen Ebene der Scheibe, wo Akquisitionen vorgenommen werden. Wie nachstehend erörtert, ist der anatomischen Ebene einer Scheibe ein wichtiger Faktor. 3A zeigt rostro-kaudal-und medial-lateral-Standorten, wo wir am erfolgreichsten. Weitere Diskussionen zu diesem Thema finden Sie in Noctor ^26. Die Integrität der Scheibe...

Diskussion

Der Hauptvorteil des Protokolls, die wir beschrieben haben, ist, dass sie eine dynamische zeitliche Auflösung der Mitose von neuronalen Vorläuferzellen. Typischerweise Assays zur Mitose im sich entwickelnden Gehirn visualisiert werden unter Verwendung von Immunfluoreszenz von fixierten Gewebeschnitten. Aber dieser Ansatz stellt nur eine Momentaufnahme der Mitose zu einem Zeitpunkt.

Es gibt mehrere Schritte, die am kritischsten für die Abbildung der Mitose in Hirnschnitten sind: 1) Die Geh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100X N2	Life technologies	17502048	for culture medium
50X B27 without vitamin A	Life technologies	12587010	for culture medium
DMEM/F12	Life technologies	11320033	for culture medium
Heat-inactivated horse serum	Sigma Aldrich	H1138-500ml	for culture medium
Heat-inactivated calf serum	Sigma Aldrich	F4135-500ML	for culture medium
FGF	R&D Sytems	3139-FB-025	for culture medium
EGF			for culture medium
10X HBSS	Life technologies	14065-056	for the dissection of the embryos
Hepes Free Acid	Sigma Aldrich	H4034	dilute to 1M (pH7.4)
2.5M D-Glucose	Sigma Aldrich	G8769	for the dissection of the embryos
0.9M NaHC03	Life technologies	25080-094	for the dissection of the embryos
low-melting agarose	Fisher	BP165-25	for generating slices
Loctite 404 glue	Loctite 404	46551	keep at 4˚C
syto11	Life technologies	S7573	Make 5µl aliquots
3 mg/ml collagen type I	Life technologies	A1048301	for culturing slices
glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-14-C	for culturing slices
petri dishes			for dissection of the embryos
digital thermometer			to measure the temperature of the agarose
spatula			to transfer brains
paintbrush			alternative to transfer brains
vibratome	Leica	VT1000s	for generating slices
dissecting microscope			dissecting out embryos
imaging microscope			A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber