Neonatal electroporación superficie pial

Resumen

La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las células hijas.

Resumen

En los últimos años la superficie pial ha sido identificado como un nicho germinal de importancia durante embrionario, perinatal y adultos neuro-y gliogénesis, incluyendo después de la lesión. Sin embargo, los métodos para interrogar genéticamente estas poblaciones progenitoras y el seguimiento de sus linajes habían sido limitadas debido a la falta de especificidad o mucho tiempo la producción de virus. Por lo tanto, el progreso en esta región ha sido relativamente lento con sólo un puñado de investigaciones de esta ubicación. La electroporación se ha utilizado durante más de una década para estudiar las propiedades de células madre neurales en el embrión, y más recientemente en el cerebro postnatal. Aquí se describe una técnica eficiente, rápido, y sencillo para la manipulación genética de los progenitores superficie pial basadas en un enfoque adaptado electroporación. Pial electroporación superficie permite el etiquetado genética fácil y manipulación de estos progenitores, lo que representa un enfoque de ahorro de tiempo y económico para el estudio de estas células.

Introducción

Células madre y progenitoras neurales están presentes en todo el SNC de mamíferos ^{1, 2.} Su naturaleza y propiedades en zonas germinales embrionarias y adultas que rodean las regiones ventriculares del cerebro y la médula espinal han sido ampliamente documentados en la década pasada ^1-3. En gran parte, esto se ha debido al desarrollo de herramientas genéticas cada vez más precisas, como el sistema nervioso específico recombinación Cre de alelos floxed o linaje retroviral trazando ^4. Sin embargo, una región-el progenitor pial progenitor superficie de la zona-sólo recientemente ha sido descrito en detalle ^5-7 y espera examen exhaustivo.

La superficie de la pía madre del cerebro se define como la interfaz entre la superficie del cerebro y las meninges que rodean ^8. Durante el desarrollo, neuroepitelial y, más tarde, radiales pies terminales gliales se adhieren a esta superficie ^{de 9,10.} Algunos de los abetosst neuronas en el cerebro humano y muchas mitosis neuronales se observan en esta región ^11. Más tarde, durante la neurogénesis embrionario, las interneuronas corticales son conocidos para atravesar la región de la pía madre, además de sus rutas migratorias en la zona intermedia y la zona subventricular ^12-14. Durante este período, las células madre pueden ser cultivadas a partir de esta zona y que parece ser un centro activo de la neuro-y gliogenesis ^5. En el cerebro adulto, se ha informado de que las interneuronas pueden nacer de progenitores superficie pial siguiente desafío hipóxico ^7. Sin embargo, la contribución de esta región a su a genensis durante el desarrollo embrionario y posnatal ha permanecido en la oscuridad, en parte debido a la dificultad de investigar específicamente esta región ^6. En el colículo superior y en la corteza cerebral, interneuronas superficiales (o capa I en la corteza) pueden modular la salida del circuito de poblaciones de neuronas excitatorias subyacentes y por lo tanto contribuir cantidaantly a la función de estas estructuras. En particular, la capa 1 interneuronas están en una posición privilegiada para regular la descarga de las neuronas a través de las capas superiores de la corteza cerebral, dada su amplia conectividad a las capas superficiales y profundas de las columnas corticales ^15,16. En una manera similar, las interneuronas horizontales reciben excitatorios de entrada a partir de fibras corticales y retinales, proyecto sobre un área relativamente amplia y se especula para mediar en la inhibición de las poblaciones neuronales que responden a estímulos visual remota ^17,18. Además, su morfología es muy adecuado para jugar un papel potencial en la actividad de las ondas con dibujos en el desarrollo del sistema visual ^19. Curiosamente, el desarrollo de las interneuronas y maduración ocurre en gran medida después del nacimiento. Además, este proceso de maduración se ha encontrado para ser regulada por la actividad neuronal y por lo tanto es un sustrato de la plasticidad del desarrollo con consecuencias de por vida sobre la función del circuito ^20,21. Notablemente, No Los promotores se describen que pueden dirigirse específicamente a estas células transgénica. La división de progenitores pueden ser dirigidos con retrovirus ^7, pero la producción de virus es mucho tiempo y requiere habilidad para producir los altos títulos necesarios para la transducción de células.

La electroporación ha llevado a un renacimiento en el estudio de desarrollo neurológico, ya que permite la interrogación genético rápido y eficiente de las vías de señalización de los progenitores neurales ^{4, 22, 23.} La electroporación implica la inyección de ADN plásmido, seguido de la entrega de pulsos eléctricos a la parte exterior de la cabeza, para conducir unidireccionalmente el ADN en los progenitores proliferantes que rodean los ventrículos ^{4, 22, 23.} La electroporación parece requerir el tránsito de células a través de la fase M del ciclo celular para la expresión de los transgenes plásmido ^24. Específicamente, se ha encontrado que sólocélulas que pasan a través de la fase M dentro de 8 horas de la electroporación de plásmidos expresarán transgenes a pesar de su entrega efectiva a todas las células dentro de ~ 160 m de la pared ventricular ^24. Se especula que esto se debe a la necesidad de la envoltura nuclear desglose en que permite un acceso nucleares de los plásmidos episomales, como los productos químicos que causan la permeabilización nuclear puede inducir la expresión de los plásmidos en las células mitóticas poste ^25. Originalmente empleado en el embrión ^22, electroporación se adaptó para su uso en el cerebro postnatal mucho más tarde ^{26, 27.} Recientemente, hemos adaptado la electroporación para su uso en la manipulación genética de los progenitores superficie pial ^6. Además, usando este enfoque, hemos demostrado que hay aparentemente dos linajes distintos de los progenitores en esta región-interneuronal y astrocítico ^6. Este protocolo detalla una manera simple, rápida y potente para atacar estas células durante el interrogatorioel desarrollo de mecanismos de regulación de estas células.

Protocolo

Este procedimiento es conforme a los requisitos Cedars-Sinai IACUC. Los investigadores deben velar por el cumplimiento IACUC institucional antes de proceder. Todas las herramientas y los reactivos deben ser esterilizados antes de su uso.

1. Preparación de herramientas, soluciones, y la mezcla de ADN

1. Inserte borosilicato pulido tubos capilares de vidrio de 100 mm de incendio en un extractor de micropipeta. Ajuste de calefacción para permitir la extracción ponderada estándar para formar la punta de la pipeta de aproximadamente 17,5 mm. Cortar las extremidades con tijeras quirúrgicas nítidas a una distancia aproximadamente de 8-9 mm desde el principio de la punta para crear más o menos una abertura de 100 micras de diámetro.
2. Hacer una reserva 1% w / v solución verde rápido mezclando agua libre de nucleasa filtrada (utilizando un filtro de jeringa de 20 micras) con el verde de secado rápido.
3. Aislar ADN purificado libre de endotoxina plásmido que está altamente concentrada (es decir,> 3 g / l), diluido en Tris-EDTA (TE) tampón. Añadir cantidades deseadas de plásmidoa la mezcla diluida en tampón TE y añadir una proporción de 1:10 de la solución de verde rápido 1% (o sea un 0,1% w / v de concentración final de verde rápido). Utilice una concentración final 0,5-2,0 g / l de plásmido para la expresión robusta de transgenes.

2. Anestesia para animales, Pipeta Loading, y Pial Superficie plásmido Inyección

1. Inducir la anestesia hipotermia en 1-2 días los ratones postnatales que los coloca en una placa de Petri que se coloca en hielo durante 5-8 minutos (dependiendo de la edad de las crías / peso del tiempo). Una vez que la hipotermia se confirma por la falta de movimiento de dedo del pie-pellizcos y / o la cola reflejo, los ratones son lista para ser inyectada. Coloca los animales de vuelta en el hielo si los reflejos de dolor son evidentes. El procedimiento de inyección y electroporación tardan menos de 2-3 minutos en total, así que tiempo de la hipotermia, la inyección, y los procedimientos de electroporación en consecuencia para mantener la anestesia adecuada.
2. Durante la anestesia, usando una pipeta estándar, cuidadosamente pipeta cantidad de plasmi desead mezclar a inyectar (0,5-2 l) en un pedazo de película de cera de parafina para referencia. Aquí, se inyecta un volumen total de 0,5 l de la mezcla de plásmido. A continuación, utilizando un inyector de micro, inserte cuidadosamente ensambladas pipeta capilar de vidrio en el tubo que contiene mezcla de plásmidos. Tome precauciones adicionales para evitar que la punta se rompa por asegurarse de que no toque los bordes del tubo. Aspirar la solución en la pipeta marcando lentamente el dial de transferencia. Una vez que un volumen suficiente ha sido cargado en la pipeta, marque hacia adelante hasta que la presión vuelve a la posición neutra de 0 hPa.
3. El uso de 300-450 hPa de presión para la inyección para asegurar la presión adecuada para el llenado uniforme de la superficie / espacio meníngeo pial, coloque la punta cerca de la inyección de parafina referencia cinematográfica cera pipeta (desde 2.2) y utilizar el pedal del inyector micro para expulsar un volumen sobre la película de cera de parafina. Ajuste la presión en consecuencia hasta que la cantidad expulsada es igual a la referenc previamente pipeteadael volumen de correo.
4. Una vez que la punta ha sido equilibrada y la anestesia se ha confirmado, cachorros están listos para ser inyectado.
5. El objetivo del experimento es para inyectar la mezcla de plásmido bajo el cráneo y por encima de la superficie de la pía madre para permitir para la electroporación de ADN hacia abajo en los progenitores superficie pial (Figura 1A). Para las inyecciones de la corteza, mantenga el cachorro hacia abajo con el pulgar y el dedo índice de la mano menos dominante. Los hemisferios corticales y otras estructuras superficiales tales como los tubérculos cuadrigéminos superiores son visibles entre P0 y P2, lo que permite la fácil orientación de estas estructuras (Figura 1B). Uso de la región dominante mano y de destino deseado de la corteza (es decir, motor, somatosensorial, etc), insertar la pipeta más allá de la piel y el cráneo con cuidado para evitar las arterias cerebrales. Asegúrese de que para evitar cualquier penetración adicional de la punta más allá del cráneo (que se indica por la falta de resistencia adicional justo después de la perforación del cráneo).
6. Inyectar plasmaID de solución mediante el pedal del inyector micro y asegúrese de que se dispersa de forma homogénea en el tejido (Figura 2A).
   Nota: Es muy importante determinar empíricamente un enfoque que maximiza la entrega plásmido evitando al mismo tiempo un hematoma debido a la presión de fluido. Esto se puede hacer mediante el ajuste de la duración de la inyección, el ángulo, el volumen, y el sitio diana precisa para evitar la interrupción vascular.
7. No deje de probar y mantener la punta de la desecación entre inyecciones colocando la punta en forma de gotitas de prueba de las inyecciones de operaciones anteriores en el papel de la cera de parafina o película plástica. Esto es necesario para evitar la acumulación de punta de solución de ADN se evaporó y se cristalizó, que puede resultar en la obstrucción de la punta y volúmenes de entrega inconsistentes.

3. Electroporación

1. Ajuste el Electroporador a 135-150 V para cinco pulsos, con una duración de 50 ms, con 950 ms en intervalos entre cada pulso. Con el fin de aumentar la conductancia yevitar la quema de la piel, cubrir de 3 mm tweezertrodes platino con gel de electroporación. Compruebe si los reflejos de los pies-pellizcos y de la cola en este punto para asegurar la anestesia. Si sensible, colocar en hielo durante varios minutos para anestesiar.
2. Para la corteza (y colículo superior) inyecciones, emplear un electrodo de 3 mm (Figura 2B) para aumentar la viabilidad de las crías (en comparación con el 7 - y 10-mm electrodos, que se utilizan para la electroporación zona ventricular). Coloque la sonda cargada negativamente del electrodo sobre la zona de inyección y la sonda cargada positivamente alrededor de la región contralateral debajo del ojo de tal manera que la orientación del electrodo es en un ángulo de 45-60 ° con relación a la línea media (Figura 2C).
3. Use el pedal del electroporador para activar la corriente y mantenga tweezertrodes en lugar de 3-5 pulsos, dependiendo de la edad de las crías y el peso, la orientación efectiva de ADN en las células de la superficie pial subyacentes en la contabilización de curvaturade los hemisferios.
   Nota: El polo negativo se puede barrer sobre la zona de inyección en entre pulsos o un electrodo más grande puede ser empleado para aumentar el área de electroporación.
4. Inmediatamente después de la electroporación, la limpieza cuidadosa del gel a partir de crías y colocarlos bajo una lámpara de calor durante aproximadamente 5 min.
5. Los cachorros serán agudamente perder su color rojizo y rosado natural en los minutos después de la electroporación por cianosis. Tenga en cuenta las crías para la recuperación de color natural y el inicio de un movimiento normal antes de devolverlos a sus jaulas.
6. Asegúrese de resocialización con la madre observando si ella trae las crías al nido y comienza la preparación de ellos. Si ella se vuelve agresivo, asegúrese de que las crías no tienen restos de gel y los incuban con algunos de la ropa de cama para transferir el olor de los cachorros.

4. Modificaciones para Apuntando al colículo superior

Orientación:

1. Inject el colículo superior de la misma manera como la corteza, pero en cuenta que la región diana se encuentra justo posterior y lateral a lambda y más o menos en la línea media (Figuras 3A y 3B). Con inyecciones exitosas, la mezcla de plásmido llena, naturalmente, los contornos de la colículo superior. Una vez que las inyecciones se han realizado con éxito, los animales están listos para la electroporación.

Electroporación:

1. De manera muy similar, para inyecciones del colículo superior, colocar la sonda cargada negativamente del electrodo sobre la zona de inyección y la sonda cargada positivamente alrededor del ojo, hocico o la barbilla, la conducción de ADN en las regiones superficiales de la colículo superior (Figura 3C) . En este caso, la orientación del electrodo es en un ángulo de 25-40 ° con relación a la línea media.

Resultados

Pial superficie resultados de electroporación en la expresión de ADN plásmido en las células progenitores-sobre todo-en o cerca de la superficie pial ^6. Más específicamente, la orientación de los electrodos es crítica en el dictado de la dirección del movimiento plásmido y expresión posterior. Por lo tanto, en configuraciones de electrodos duales, el plásmido está dirigida más o menos en un vector recta entre el electrodo negativo y positivo. Por lo tanto, si el polo negativo se coloca sobre el ...

Discusión

El aspecto más crítico para la electroporación éxito de progenitores superficie pial son: 1) la orientación de la mezcla de plásmido a la superficie de la pía madre; 2) evitando la generación de hematomas en el lugar de la inyección; y 3) evitar la mortalidad asociada con la electroporación mesencéfalo.

Apropiadamente la orientación de la superficie de la pía madre se lleva a cabo por punción medido y cuidadoso del cráneo para evitar la penetración de la superficie de la pía...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3-mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09