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  • Zusammenfassung
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  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das hierin beschriebene Protokoll zielt darauf ab, zu erläutern und verkürzen die zahlreichen Hindernisse in den Weg der komplizierten Weg führt zu modifizierten Nukleosidtriphosphaten. Folglich dieses Protokoll erleichtert sowohl die Synthese dieser aktiviert Bausteine ​​und ihre Verfügbarkeit für die Praxis.

Zusammenfassung

Die traditionelle Strategie für die Einführung von chemischen Funktionalitäten ist die Verwendung von Festphasensynthese durch Anhängen geeigneter Weise modifizierten Phosphoramidit-Vorläufern zu der entstehenden Kette. Jedoch sind die bei der Synthese und der Beschränkung auf eher kurze Sequenzen verwendeten Bedingungen behindern die Anwendbarkeit dieser Methode. Auf der anderen Seite werden modifizierte Nukleosidtriphosphate Bausteine, die für die leichte Einführung zahlreicher funktioneller Gruppen in Nukleinsäuren, eine Strategie, die den Weg für die Verwendung von modifizierten Nukleinsäuren in einer weitreichenden Palette von praktischen Anwendungen verwendet worden sind, ebnet aktivierten wie funktionelle Tagging und Generierung von Ribozymen und DNAzyme. Eine der größten Herausforderungen liegt in der Komplexität der Methode, die zur Isolierung und Charakterisierung dieser Nukleosid-Analoga.

In diesem Video-Artikel, ein ausführliches Protokoll für die Synthese von thes präsentieren wire modifizierten Analoga mit Phosphor (III)-basierenden Reagenzien. Darüber hinaus wird das Verfahren für ihre biochemische Charakterisierung weitergegeben, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Primerverlängerungsreaktionen und TdT Tailing-Polymerisation. Diese detaillierte Protokoll wird für die Verwendung des Handwerks von modifizierten dNTPs und ihre weitere Verwendung in der chemischen Biologie sein.

Einleitung

5'-Nukleosid-Triphosphate ((d) Hohlstunden) stellen eine Klasse von lebenswichtigen Biomolekülen, die in zahllosen Prozessen und Funktionen, angefangen davon, dass die universelle Währung der Energie, um Regulatoren der Zellstoffwechsel beteiligt sind. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei dieser grundlegenden biologischen Veränderungen, ihre modifizierten Gegenstücke als vielseitiger und leichter Plattform für die Einführung von funktionellen Gruppen in Oligonukleotide, einer Methode, die gut ergänzt die automatisierte Festphasensynthese, die normalerweise angewendet wird 1,2 schoben. Ja, vorausgesetzt, die (d) Hohlstunden können als Substrate für RNA-und DNA-Polymerasen 3, eine Fülle von Funktionsgruppen einschließlich Aminosäuren 4-13, Boronsäuren 14,15, nornbornene 16, diamantartige Rückstände 17, Seitenketten für handeln Organokatalyse 18, Gallensäuren 19 und sogar 20-Oligonukleotide können in Oligonukleotide eingeführt werden.

_content "> Darüber hinaus repräsentiert eine günstige Vektor für die Funktionalisierung von Nukleinsäuren können modifiziert dNTPs in SELEX und andere kombinatorische Verfahren der in vitro-Selektion für die Erzeugung von modifizierten katalytischen 21-30 Nukleinsäuren und Aptamere für verschiedene praktische Anwendungen 10 in Eingriff gebracht werden, 31-36. Die zusätzlichen Seitenketten, die durch die Polymerisation der modifizierten dNTPs eingeführt werden, werden gedacht, um den chemischen Raum, die bei einem Selektionsexperiment erforscht werden können und ergänzen die eher schlechte funktionelle Arsenal von Nukleinsäuren 37 zu erhöhen. Trotz dieser attraktiven Eigenschaften und die jüngsten Fortschritte in der Entwicklung der beiden synthetischen und analytischen Methoden gemacht, keine allgemein gültige und hochverzinslichen Verfahren besteht für die Crafting-modifizierter Nucleosidtriphosphaten 2,38.

Ziel dieses Protokolls ist es, Licht in die (manchmal) komplizierte Verfahren, die t Schuppeno Die Synthese und biochemische Charakterisierung dieser aktivierten Bausteine ​​(Abbildung 1B). Besonderer Wert wird auf alle synthetischen Details, die oft schwer zu finden oder nicht vorhanden sind in der experimentellen Abschnitte sind aber noch entscheidend für den erfolgreichen Abschluss des synthetischen Weg führt auf die Isolierung von reinem (d) Hohlstunden (Abbildung 1) gegeben werden.

Protokoll

1. Synthese der modifizierte Nukleosidtriphosphate

Der synthetische Ansatz gewählt wurde nach dem von Ludwig und Eckstein entwickelt, da diese Methode in der Regel zuverlässig und führt zu sehr wenige Nebenprodukte (Abbildung 1A) 39 Verfahren.

  1. Coevaporate die entsprechend 3'-OAc-Nucleosid (typischerweise 0,1 mmol) zweimal mit wasserfreiem Pyridin (2 ml) und dann unter Vakuum über Nacht trocknen. Zur gleichen Zeit, trocken Tributylammoniumpyrophosphat (0,13 mmol) über Nacht unter Vakuum.
  2. Lösen Sie das Nukleosid in einem Minimum von trockenem Pyridin (0,2 ml) und fügen trockenem Dioxan (0,4 ml) als Co-Lösungsmittel. Schließlich fügen 2-Chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol) und lassen bei Raumtemperatur für 45 Minuten reagieren.
    Anmerkung: Es ist bemerkenswert, dass besondere Sorgfalt sollte mit dem 2-Chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on-Reagenz entnommen werden. Ja sogar Lagerung dieses Reagenz unter Inertgas-Atmosphäre,hier nicht ausreicht, um seine Zersetzung zu verhindern. Somit ist die, die in diesem Zersetzung gebildete weiße Feststoff kann und sollte vor der Verwendung aus abgekratzt werden.
  3. Bereiten Sie eine Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat in trockenem DMF (0,17 ml) und frisch destilliertem Tributylamin (58 ul; Molekularsiebe nie hinzufügen). Hinzufügen der resultierenden Lösung zu dem Reaktionsgemisch (ein weißer Niederschlag erscheint, aber schnell verschwindet) und lassen bei Raumtemperatur für 45 Minuten reagieren.
  4. Bereiten Sie eine Lösung von Iod (0,16 mmol) in Pyridin (0,98 ml) und H 2 O (20 ul) und zu der Reaktionsmischung, um die P &agr; oxidieren (III)-Zentrum. Die entstehende dunkle Lösung auf Raumtemperatur für 30 min gerührt.
  5. Verwenden eine 10% ige wässrige Lösung von NaS 2 O 3, die I 2-Überschuß zu löschen. Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum (die Temperatur des Wasserbades des Rotationsverdampfers muss unter 30 ° C gehalten werden). In H 2 O (5 ml) und erlauben dem mixture bei Raumtemperatur für 30 min stehen gelassen, um das zyklische Triphosphat-Rest hydrolysiert.
  6. Auf dieser Stufe werden die Schutzgruppen in der Regel (dh 3'-OAc und die Gruppen an den Seitenketten der Nukleobase) entfernt. Folglich fügen NH 4 OH (30% in H 2 O, 10 ml) zu dem rohen und rühre 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum.
  7. 2 ml H 2 O und aufgeteilt in 2 Röhren. Hinzufügen von 12 ml einer 2% igen Lösung von NaClO 4 in Aceton und Zentrifuge (1.000 × g) für 30 min. Dieser Vorgang wird noch einmal wiederholt. Diese Ausfällung ermöglicht die Abtrennung der Lösungsmittel und Reagenzien für die Synthese von Triphosphat (die Ausfällung wird) verwendet, wodurch die anschließende RP-HPLC-Reinigung wesentlich vereinfacht.
  8. Nach Lufttrocknung der ölige Rückstand, notieren Sie eine 31-P-NMR-Spektrum des Rohproduktes (Standardverfahren, siehe auch Liste der Materialien und Abbildung 3) undin 4 ml H 2 O lösen,
    Anmerkung: Diese Syntheseverfahren konzentriert sich hauptsächlich auf die Erzeugung von modifizierten Desoxynucleosidtriphosphate, aber ein sehr ähnliches Verfahren kann für die RNA-Gegenstücke (einfach durch Verwendung von 2 ', 3'-Bis-O-acetylierten Vorstufen) angewendet werden.

2. HPLC-Reinigung der modifizierte Nukleosidtriphosphate

  1. Herstellung einer 1 M Stammlösung von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB): 40
    1. Eine Lösung aus 1 Mol Triethylamin (139 ml) in ≈ 600 ml destilliertem und filtriert H 2 O
    2. Bubble-CO 2 (Trockeneis und über eine Gaswaschflasche) in die Lösung unter kräftigem Rühren, bis ein pH-Wert von 7,6 erreicht ist (dies wird mindestens 10 Stunden dauern). Diese Stammlösung kann im Kühlschrank bis zu einem Monat aufbewahrt werden.
  2. Reinigung:
    1. Bereiten Sie zwei Pufferlösungen von der 1 M Lager: 2 L 50 mM TEAB in ultrareinem Wasser (Laufmittel A) einnd 1 l 50 mM TEAB in 50% MeCN (Laufmittel B). Entgasen beide Eluenten unter Vakuum und Rühren für 20 min (Aufmerksamkeit wird, um nicht den pH-Wert durch Entfernen von CO 2 während der Entgasung ändern erforderlich).
    2. Vorbereitung einer Analyseprobe, indem 10 ul des rohen Triphosphat in 300 &mgr; l destilliertem H 2 O und Injizieren in ein HPLC-System mit einer semi-präparative RP-Säule (C18) ausgerüstet ist und mit einem Gradienten von 0-100% B in 40 min (Abbildung 4). Stellen Sie die HPLC-Programm nach der R t des Triphosphats (was in der Regel der Hauptpeak im Chromatogramm) und das Diphosphat (die einen etwas niedrigeren R t hat). Das rohe Gemisch mit diesen Bedingungen und durch Entfernen frühen Fraktionen, die einige Diphosphat enthalten könnten.
    3. Vereinen alle Fraktionen, die das Produkt enthalten und gefrierTrocken (die, um die Hydrolyse zu der unerwünschten diphosph Minimierung der Verdampfung am Rotationsverdampfer bevorzugtate). Coevaporate mehrmals mit Reinstwasser (zum Rest Triethylamin aus den Eluenten entfernen). Bewerten Sie die Reinheit der NMR-Triphosphat (beide 1 H-und 31 P-NMR) und MALDI-TOF durch Anwendung von Standardprotokollen (siehe Abbildung 5). Typische Ausbeuten durch Anwendung dieses Protokolls erhaltenen liegen typischerweise im Bereich von 30-70%, abhängig von dem Substrat.

3. Primerverlängerungsreaktionen und TdT Polymerisation

  1. 5'-Endmarkierung des Primers
    1. Mischungs 30 pmol der entsprechenden Primer (z. B. P1, Materialliste) mit 4 ul 10x-Polynukleotidkinase (PNK)-Puffer, 3 &mgr; l γ-[32 P]-ATP, 1 ul PNK und ddH 2 O (für ein Gesamtreaktionsvolumen von 40 ul). Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 30 min und dann wärme deaktivieren Kinase (10 min bei 70 ° C).
    2. Während der Markierungsreaktion vorbereitenein G10 Sephadex-Säule durch Einstecken einer 1 ml Pipettenspitze mit silanisierten Glaswolle und Füllen der Spitze mit G10-Lösung (10% in ddH2O, autoklaviert). Spin down und dreimal mit 500 ul ddH 2 O und einem letzten Waschen mit 50 ul ddH 2 O. Führen Sie das Reaktionsgemisch durch den G10 (um die freie radioaktive Markierung entfernen).
    3. Gel reinigen (PAGE 20%) die radioaktiv markierten Primer und erholen sich durch die Anwendung der Andrang und genießen Verfahren (dh die Elution mit 500 ul einer wässrigen Lösung mit 1% LiClO 4 und 1 mm Netto 3 (pH 8) bei 72 ° C für 15 min). Ethanol Niederschlag und G10 entsalzen das eluierte Oligonukleotid.
  2. Primer-Extension-Reaktion
    1. Glühen 1 pmol radioaktiv markierten Primer P1, 10 pmol Primer P1 und 10 pmol Vorlage T1 (Materialliste) in 10x Reaktionspuffer (durch den Lieferanten der Polymerase verwendet werden zur Verfügung gestellt), indem Sie den tube in heißem (90-95 ° C) Wasser und durch die Möglichkeit, schrittweise abkühlen auf Raumtemperatur (über 45 min).
    2. Setzen Sie die Röhrchen auf Eis und fügen Sie (wiederum) die dNTP-Cocktail (die sowohl die modifizierte und die natürlichen Triphosphate, 100 uM Endkonzentration) und 1 U der DNA-Polymerase (Vent (exo -) Klenow, Pwo oder 9 ° N m) und komplett mit Wasser (für eine Gesamtreaktionsvolumen von 20 ul). Inkubieren bei der optimalen Arbeitstemperatur des Enzyms (z. B. 60 ° C für 30 min bei Vent (exo -) verwendet wird).
    3. In 20 ul-Stop-Lösung (Formamid (70%), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 50 mM), Bromphenolblau (0,1%), Xylencyanol (0,1%)), erhitzen die Proben (95 ° C, 5 min), cool unten (0 ° C), und lösen durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Visualisieren von Phosphor.
  3. TdT Polymerisation
    1. Jeweils 7 pmol Einzelstrang-Unmarkierte Primer P2 (Materialliste), 1 pmol radioaktiv markierter Primer in 1 ul TdT-Puffer 10x.
    2. Setzen Sie die Röhrchen auf Eis und fügen Sie (wiederum) die dNTP-Cocktail (in ausreichender Konzentration zwischen 10 und 200 um liegt) und der Polymerase TdT (4 U). Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. Werden 10 ul der Stop-Lösung, Erwärmen der Proben (95 ° C, 5 min), Abkühlen (0 ° C) und löst durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE 15%). Visualisieren von Phosphor.

4. PCR mit modifizierten Nucleosidtriphosphaten

  1. Mischen 8 pmol sowohl die Vorwärts-und Rückwärts-Primern mit 0,5 pmol der Template amplifiziert werden. In 10x Reaktionspuffer und die dNTP-Cocktail (für eine 200 uM Endkonzentration), das Glas auf Eis. 1 U der DNA-Polymerase und komplett mit H 2 O auf ein Endvolumen von 20 &mgr; l zu erreichen. Übertragen Sie die Mischung in ein PCR-Röhrchen und führen 30 PCR-Zyklen.
  2. Verdünnen 6 ul mit 6 ul 2x Saccharose-Ladepuffer und lösen durch Agarose 2%-Elektrophorese (gefärbt mit Ethidiumbromid). Visualisieren von Phosphor.

Ergebnisse

Geändert Nucleosidtriphosphaten sind verlockend Syntheseziele, da sie ermöglichen die einfache Einführung einer Vielzahl von funktionellen Gruppen in Nukleinsäuren 41. Jedoch ist die Isolierung und Charakterisierung dieser aktivierten Bausteine ​​oft mühsam, offenbart ist. Daher sind die hier gezeigten Ergebnisse gedacht, um eine helfende Hand bieten, um die verschiedenen Schritte innerhalb der zuvor genannten synthetischen und biochemischen Verfahren (Abbildung 1B) zu folgen.

Diskussion

Die Einbeziehung von Änderungen in Nukleinsäuren ist von Interesse für viele praktische Anwendungen, einschließlich der Entwicklung von Antisense-und Antigen-Mittel 42,43, Kennzeichnung und Funktions Tagging von Oligonukleotiden 41 und bei den Bemühungen um die genetische Alphabet 44-46 ausbauen. Die chemischen Änderungen und Funktionsgruppen werden in der Regel durch die Anwendung von Standard-und automatisierte Festphasensynthese Protokolle in Nukleinsäuren eingeführt. Allerdin...

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds (Grants Nr. PZ00P2_126430 / 1 und PZ00P2_144595) unterstützt. Prof. C. Leumann ist dankbar für die Bereitstellung der Laborflächen und Geräte, sowie für seine ständige Unterstützung. Frau Sue Knecht ist für fruchtbare Diskussionen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
tributylammonium pyrophosphate Sigma AldrichP8533Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Sigma Aldrich324124Moisture sensitive
PyridineSigma Aldrich82704Under molecular sieves
DioxaneSigma Aldrich296309Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Under molecular sieves
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC grade
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdeionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR vialsBioconcept3220-00
HPLC systemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

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