Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

Zusammenfassung

Die Behandlung der primären Maus Osteoblasten mit Retinsäure erzeugt eine homogene Population von verzweigten Zellen, die morphologischen und molekularen Merkmalen des Osteozyten. Das Verfahren überwindet die Schwierigkeiten bei der Erlangung und Aufrechterhaltung der primären Knochenzellen in Kultur, und kann vorteilhaft sein, Zellen aus transgenen Modellen abgeleitet studieren.

Zusammenfassung

Die Notwendigkeit für osteocyte Kulturen ist gut für die Gemeinschaft der Knochenforscher bekannt; Isolierung von primären Knochenzellen ist schwierig und produziert niedrigen Zellzahlen. Daher ist die am meisten verwendete Zellsystem die Osteozyten-ähnliche MLO-Y4-Zelllinie.

Das hier beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Verwendung von Retinsäure, um eine homogene Population von Zellen, die mit verzweigten morphologischen und molekularen osteocyte Eigenschaften zu erzeugen.

Nach Isolierung von Maus-Calvaria Osteoblasten, ist all-trans-Retinsäure (ATRA) zur Zellmedium zugegeben und Zellenüberwachung wird täglich unter einem Umkehrmikroskop durchgeführt. Erste morphologische Veränderungen nach 2 Tagen der Behandlung und Differenzierung nachweisbar ist im allgemeinen innerhalb von 5 Tagen vollständig, mit fortschreitenden Entwicklung von Dendriten, Verlust der Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix zu erzeugen, die Herunterregulierung der Osteoblastenmarkern und Hochregulierung von Osteozyten-spezifischen Molekülen. Inhalt "> Tägliche Zellenüberwachung ist wegen der inhärenten Variabilität der Primärzellen benötigt werden, und das Protokoll kann mit minimaler Variation, um Zellen von verschiedenen Mausstämmen erhalten und transgene Modelle angewendet angepasst werden.

Das Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert keine spezielle Instrumentierung erforderlich, es in hohem Maße reproduzierbar ist, und erzeugt schnell eine ausgereifte Osteozyten Bevölkerung in vollständiger Abwesenheit von extrazellulären Matrix, was die Verwendung dieser Zellen für unbegrenzte biologische Anwendungen.

Einleitung

Osteozyten, die häufigste Knochenzelltyp sind terminal differenzierte, hochverzweigten Zellen tief in das Skelett entfernt. Der Zellkörper der reifen Knochenzellen werden im Knochen Lücken enthalten und haben unterschiedliche Formen; Osteozyten mit länglichen Zellkörper sind in den kortikalen Knochen gefunden, während abgerundete Osteozyten sind häufiger in der trabekulären Knochen ^ein. Verzweigte Dendriten erstrecken sich vom Zellkörper und befinden sich in winzigen Kanälen Kanälchen genannt, bilden ein komplexes Netz, das mehrere Kontakte nicht nur mit anderen Osteozyten, sondern auch mit anderen Knochenzelltypen, Knochenmark, Blutgefäße und damit verbundene Perizyten macht. Durch die Lücken und Kanälchen in der interstitiellen Flüssigkeit enthalten, sind Osteozyten letztlich auch dem Umlaufsystem verbunden, deshalb sind sie nicht nur lokale, sondern auch systemische Ereignisse, und umgekehrt, ihr Verhalten kann sowohl von lokalen und systemischen Veränderungen ² geregelt werden, beeinflussen können.

DieStudium der Osteozyten hat vor kurzem an Dynamik gewonnen, dank einiger technischer Verbesserungen, wie die Erzeugung von Gewebe-und zellspezifische transgene Tiere, die Verwendung von leistungsstarken Mikroskopie-Techniken und der Hochdurchsatz-Screening Molekular ^3,4. Allerdings ist die Kenntnis dieser Zellen noch unvollständig, vor allem aufgrund der relativen Knappheit von angemessenen in vitro-Modellen. Eigentlich habe Osteozyten immer schwierig, wegen der tiefen Lage zu erhalten und zu pflegen in der Kultur, und das niedrige Niveau der Verbreitung, die eine solche differenzierte Zelltyp charakterisiert.

Entlang der Jahre eine Reihe von Methoden entwickelt worden, um primäre Knochenzellen ^5-7 isolieren, obwohl sie produzieren in der Regel niedriger Zellausbeuten und tragen das Risiko, dass sogar ein paar verunreinigen Fibroblasten schnell überwuchern die Osteozyten ^8. Aus diesem Grund sind die meisten experimentellen in vitro Arbeit wurde bisher auf die etablierten osteocyte Zelle l durchgeführtine MLO-Y4 ^9.

Weitere In-vitro-Methoden könnte die Möglichkeit der Untersuchung dieser Zellen zu erhöhen und könnte die Analyse der osteocyte Biologie und Pathophysiologie verbessern. Um weitgehend angenommen werden, sollten diese Methoden einfach zu reproduzieren, und würde nicht verlangen, spezielle Instrumente oder sehr lange Zeiten Zellreifung zu erreichen. Wichtig ist, wenn für Primärzellen, würden sie machen es möglich, die Vorteile von transgenen Tieren zu nehmen. Wir haben kürzlich beschrieben, dass die Behandlung der Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 und der primären Osteoblasten mit Retinsäure induziert eine rasche Änderung Phänotyp führt zu der Entwicklung einer homogenen Population von Zellen, die verzweigte morphologische und molekulare Merkmale von Osteozyten ^10.

All-trans-Retinsäure (ATRA) ein aktives Stoffwechselprodukt von Vitamin A, die Gen-Transkription reguliert durch Bindung der Kern Retinsäure-Rezeptoren (RARs). RARan DNA binden als Heterodimere mit dem Retinoid-X-Rezeptoren (RXRs), letztlich auf die Modulation von Retinsäure (RA) ansprechenden Zielgene ¹¹ führt. ATRA ist gezeigt worden, die Differenzierung und Reifung von mehreren Zelltypen zu modulieren, darunter andere verzweigte Zellen, wie Nervenzellen ¹² und ¹³ podocytes.

Das hier beschriebene Verfahren wird nach Zugabe von ATRA an primären Osteoblasten basiert. Um wirksam zu sein, muss ATRA an einer präzisen Reifestufe auf Zellen in einem definierten Dichte ausplattiert hinzugefügt werden; Nach unserer Erfahrung diese Bedingungen sind für den Phänotyp Schalter von Osteoblasten Osteozyten erhalten.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach der aktuellen nationalen und europäischen Vorschriften über den Schutz von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet und überprüft wurden und von der Ethikkommission der Universität Mailand durchgeführt genehmigt.

1. Isolierung von Primär Osteoblasten

Die Methode, mit geringfügigen Änderung, nach dem von Dodig et al ¹⁴ beschrieben ist.

1. Vorbereitung Digestionsmittel, durch Zugabe von 0,1% Collagenase P und 0,05% Trypsin (ab 2,5% Trypsin 10X, ohne Phenolrot) mit HBSS-Medium (Hanks Balanced Salt Solution, ohne Calcium, Magnesium oder Phenolrot).
2. Verwenden Sie 3-4 Tage alten Mäusen (das Verfahren kann so wenig wie 1-Maus angewendet werden.)
3. Sacrifice durch Enthauptung. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol und auf Eis zu halten. Entfernen Sie Haut-und Muskelschichten durch Pinzette und Seziersaal / chirurgische Schere.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Scheitelbeine undtrennen Sie diese, indem Sie die Pfeilnaht in zwei Hälften. Stellen Sie sicher, Knochen sind frei von Nähten und anhaftendem Gewebe und legen einzelnen Knochenstücke in gut-Platten mit HBSS Medium, bis das Verfahren abgeschlossen ist.
5. Entsorgen HBSS und fügen Sie in jede Vertiefung der Digestionsmittel für 15 min bei 37 ° C
6. Überstand verwerfen.
7. Fügen Sie die Verdauung wieder Medium für 15 min bei 37 ° C
8. Diese Zeit zu sparen den Überstand und legen Sie sie in alpha-MEM (Minimum Essential Medium) mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1% Streptomycin / Penicillin.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8 2x.
10. Pool der drei Fraktionen gesammelt, Spin-Zellen durch Zentrifugation bei 425 g für 5 min den Überstand verwerfen, 3 ml ergänzten alpha-MEM, um das Zellpellet resuspendieren und in ein 25 cm ^2-Kolben.
11. Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden, um Schmutz und abgestorbene Zellen zu entfernen.
12. Dann werden 50 &mgr; g / ml Ascorbinsäure (AA) und 3 mM GlyCEROL 2-phosphat Dinatriumsalz-Hydrat (GP) an die alpha-MEM-Medium.
13. Danach ändern Sie die Medium (MEM alpha-Plus AA / GP) jeden zweiten Tag.

2. ATRA-Protokoll

1. Führen Sie alle Experimente mit ATRA (All-Trans-Retinsäure) in einem abgedunkelten Raum, um die Inaktivierung zu verhindern.
2. Bereiten Sie eine 1X Trypsin-Lösung in HBSS Medium und halten bei 37 ° C bis zur Verwendung.
3. Entfernen Sie das Medium aus subkonfluente Zellen und waschen Sie sie sorgfältig mit HBSS.
4. 1 ml Trypsin, sanft drehen Sie den Kolben, damit alle Zellen durch Trypsin abgedeckt werden, und Inkubation für 3 min bei 37 ° C
5. Überprüfen Sie für die eigentliche Ablösung von Zellen unter einem inversen Mikroskop.
6. 3 ml alpha-MEM-Medium, um Trypsin zu inaktivieren.
7. Recover die Zellen und Zentrifugieren für 15 min bei 425 g.
8. Zellpellet in frischem Medium.
9. Geben Sie einen Tropfen in einer Zählkammer Zählkammer, zu ermöglichen, für ein paar Minuten absetzen und zählen die cell Nummer.
10. Ort Zellen in 25 cm ^2-Kolben in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm ² mit Alpha-MEM sowie AA / GP. Seien Sie sich bewusst, dass die Zelldichte, die für die optimale Entwicklung von Zellprozessen und interzellulären Kontakten. Ein Ausgangsdichte von mehr als 10.000 Zellen / cm ² beeinträchtigt die richtige Entwicklung von Zellprozessen, aber niedrigere Zellzahlen führen zu vorzeitigem Zelltod aufgrund der Abwesenheit von interzellulären Kontakten.
11. In 5 uM ATRA auf das Medium alle 24 Stunden.
12. Überwachen Sie die Zellen täglich Morphologie beurteilen: morphologische Veränderungen werden in der Regel nach 48 Stunden beobachtet. Wenn nach der ersten 24-48 Stunden werden die Zellen noch proliferierenden, Ausstrich auf die oben Dichte. Eine homogene Population von reifen Knochenzellen vorhanden ist, nach 4-5 Tagen. Abhängig von den Anforderungen, zu verwenden Zellen zu jedem Zeitpunkt, bis zu 12-15 Tagen.
13. Wenn Zellen auf anderen Trägern (wie Deckgläser oder Well-Platten) plattiert, sicher sein, dass die oben Dichte beibehalten wird undATRA weiterhin alle 24 Stunden bis zur Verwendung hinzufügen. Zellen lassen sich an die neue Träger für mindestens 24 h vor dem Experiment zu haften.

3. Immunfärbung

1. Für Immunfärbung Platte die Zellen auf Deckgläsern und folgen etablierten Methoden (siehe zB Burry ^15).
2. Zum Beispiel kann für die indirekte Immunfluoreszenz, fix in 4% Paraformaldehyd oder kaltem Aceton inkubiert sequentiell mit dem primären Antikörper bei RT für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, dann mit der fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper im Dunkeln bei RT für 30 min, in einer befeuchteten Kammer.
3. Verwenden DAPI oder Analoga für die Kerngegenfärbung, und montieren in der Anti-Fading-Medium.

4. Alizarinrot Färbung und Extraktion

1. Platte die Zellen auf Deckgläsern.
2. Fixieren die Zellen durch Eintauchen des Deck in 70% Ethanol für 10 min.
3. Decken Sie die Zellen mit einigen Tropfen Alizarin-Rot-Färbung-Lösung (1 mg / ml, pH 5,5)für 30 min.
4. Mit Leitungswasser waschen Sie die Deckgläser. Montieren Sie mit einem Tropfen Glycerin auf Glasobjektträger und nehmen Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop bei 10X und 20X Vergrößerung.
5. Nach dem obigen Verfahren erholen die Deckgläser durch Eintauchen der Objektträger in Leitungswasser.
6. Setzen jedes Deckglas in einem Well-Platte.
7. In 60% Perchlorsäure (die Menge hat, genug, um die Zellen vollständig bedeckt sein) und lassen O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
8. Messen der optischen Dichte des Überstands durch Spektrophotometrie bei 450 nm Wellenlänge.
9. Um Werte für die Zellzahl zu normalisieren, fügen Janus Green (0,2% ige Lösung in PBS), um die Zellpräparation für 10 Minuten abdecken.
10. Sorgfältig mit hochreinem Wasser waschen.
11. In 0,5 N HCl (die Menge hat, genug, um alle Zellen zu decken) und schütteln mit der Hand ein paar Sekunden.
12. Die Absorption bei 615 nm spektralphotometrisch.

Ergebnisse

Ergebnisse wurden zwischen 5 und 10 unabhängigen Experimenten erhalten.

Zellmorphologie

AA / GP behandelt Primärzellen haben meist Kopfsteinpflaster-ähnliche Funktionen, die charakteristisch für reife Osteoblasten. Dazwischen verzweigten Zellen (wie durch die roten Pfeile in 1A angegeben) gefunden werden kann, die wahrscheinlich einige Osteozyten stellen.

Mit ATRA-Behandlung, Zellen beginnen rasch Anzeige Verzweigungen,...

Diskussion

In den letzten Jahren hat sich die Osteozyten als die zentrale Zelle im Knochen entstanden. Fortschritte in der Forschung schrittweise enthüllt eine Reihe von bisher unbekannten oder unbewiesen osteocyte Eigenschaften, die für die Gestaltung von neuen und besseren Behandlung für eine Vielzahl von Knochenerkrankungen von enormem Wert sind. Allerdings hat die Untersuchung von osteocyte Biologie an der begrenzten Verfügbarkeit von in-vitro-Modelle leidet so sehr, dass Osteoblasten haben als Ersatzzellen über ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat #	comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37°C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37°C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight,10cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
microscope	Zeiss Apotome
spectrometer	Safas Xenius