qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

Resumen

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Resumen

Es crucial para identificar la infección por citomegalovirus (CMV) en el tracto gastrointestinal (GI) de los pacientes inmunodeprimidos, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Muchos métodos de laboratorio para la detección de la infección por CMV se han desarrollado, incluyendo serología, el cultivo viral y métodos moleculares. A menudo, estos métodos reflejan afectación sistémica por CMV y no identifican específicamente la participación del tejido local. Por lo tanto, la detección de la infección por CMV en el tracto gastrointestinal se realiza con frecuencia por la histología tradicional de tejido de la biopsia. La tinción con hematoxilina y eosina (H & E) en conjunción con técnicas de inmunohistoquímica (IHC) se han mantenido los pilares de examinar estas biopsias. H & E e IHC veces resultan en (dudosos) patrones de tinción atípicos, lo que hace difícil la interpretación. Se demostró que la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para CMV con éxito se puede realizar en fijado en formol, tejido de biopsia incrustado en parafina (FFPE) de muyalta sensibilidad y especificidad. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo llevar a cabo las pruebas de qPCR para la detección de CMV en tejido de biopsia FFPE en un laboratorio clínico. Este método es probable que sea de gran beneficio para los pacientes en los casos de la aparición de manchas por CMV en biopsias GI.

Introducción

Interpretación de la infección por citomegalovirus (CMV) en muestras clínicas es críticamente importante. CMV es un miembro de la subfamilia Betaherpesvirinae de herpesvirus. Al igual que otros virus de herpes, CMV tiene la capacidad de establecer una infección persistente o latente que se caracteriza por una falta de replicación viral activa ^1. La reactivación del virus puede producirse en momentos de estrés o de otro tipo de inmunosupresión, lo que lleva a la replicación viral activa caracterizada por la liberación de viriones, que puede estar acompañado de manifestaciones de la enfermedad ^2-4. Gastrointestinal (GI) los síntomas de la enfermedad por CMV con frecuencia incluyen dolor abdominal y / o heces con sangre ^1.

El diagnóstico de CMV gastroenteritis por histología utiliza hematoxilina y eosina (H & E) para identificar inclusiones virales de CMV. En los casos en que es alto pero no se observan inclusiones obvias sospecha clínica, inmunohistoquímica (IHC) se utiliza con frecuencia como un método de prueba adjunto. Sin embargo, IHCtambién puede verse obstaculizada por los patrones raros no aparecen clásicos de tinción celular (ambiguas), lo que hace difícil la interpretación (Figura 2) ^5. Se trató de utilizar ADN extraído de fijado con formalina, embebido en parafina (FFPE) tejido de la biopsia GI y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para detectar CMV en biopsias GI. Esta técnica ha demostrado ser valiosa en la detección de CMV en biopsias GI, y es particularmente útil en los casos de tinción IHC equívocos ^5,6. También, qPCR también se ha demostrado que se correlaciona bien con los datos de prueba de CMV clínico adicional cuando está disponible ^6. El uso de qPCR para detectar CMV puede llevar a un diagnóstico precoz y el tratamiento en los casos en que la sospecha clínica para el CMV es alta, pero H & E y CMV IHC son negativos.

Protocolo

Con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional, se realizó una búsqueda en la base de datos de laboratorio electrónico para identificar fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) bloques que representan los casos de infección por citomegalovirus (CMV) en gastrointestinal (GI) biopsias diagnosticadas por histopatología (hematoxilina y eosina (H & E) y / o inmunohistoquímica (IHC)).

1. Procesamiento de tejido de FFPE GI biopsia de tejido

1. Recoger FFPE GI bloques de tejido de biopsia para el citomegalovirus (CMV) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Estos bloques se almacenan a temperatura ambiente.
2. Tubos Pre-label 1,7 ml de microcentrífuga con número de identificación único de la cuadra.
3. Bloquee el volante microtomo.
4. Asiente el bloque de tejido en la abrazadera de cassette.
5. Utilizando una cuchilla nueva sin usar, alinee el bloque al ángulo cuchillo en el microtomo.
6. Ajuste el micrótomo para cortar 10 micras de espesor secciones.
7. Desbloquear ªe volante y avanzar el bloque hacia la hoja.
8. Cortar 5 secciones del bloque a intervalos de espesor 10 micras, permitiendo que cada corte a rodar en un rollo de tejido. Asegúrese de que cada rollo contiene una representación adecuada de los tejidos de biopsia deseados.
9. Bloquee el volante microtomo.
10. Con unas pinzas, colocar todos los 5 rollos de tejido en el tubo de centrífuga de pre-marcado, teniendo cuidado de sólo manipular el desplazamiento por la parafina con el fin de reducir el potencial de contaminación cruzada. Coloque la tapa en el tubo y colocarlo de nuevo en el estante.
11. Retire el bloque de tejido del microtomo.
12. Retire y deseche la hoja.
13. Descontaminar las superficies o utensilios que puedan haber estado en contacto con el tejido anterior.
14. Coloque una hoja nueva sin usar en el soporte de la cuchilla.
15. Repetir los pasos 1.4 a 1.14 para cada bloque adicional para ser procesado. Los tubos de microcentrífuga que contenían los rollos de tejido se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta que el time de la extracción de ADN.

2. Extracción de ADN de Rollos de FFPE GI biopsia de tejido

NOTA: Este protocolo es una adaptación del prospecto del kit FFPE tejido de ADN de extracción (PRECAUCIÓN: consulte la Hoja de Seguridad (MSDS)).

1. Añadir 1 ml de xileno (PRECAUCIÓN: Consulte la MSDS) para cada tubo de microcentrífuga muestra. Cierre la tapa y agitar vigorosamente durante 10 segundos.
2. Proceder a la extracción de ADN específicamente indicado en el prospecto del producto del fabricante con las siguientes modificaciones.
3. En primer lugar añadir 6 l de la de control interno (IC) a cada tubo de microcentrífuga.
   1. Después de la ATL / proteinasa K de incubación de lisis a 56 º C durante 1 h, se incuba a 99 ° C durante 30 min, en lugar de 90 ° C durante 1 hora.
   2. Durante el paso final de elución de ADN, abrir con cuidado la tapa de la columna de purificación de ADN y aplicar 50 l de DNasa / RNasa libre de agua destilada en el centro de la membrana, en lugar de Buffer ATE.
      NOTA: Consulte el prospecto del envase para el almacenamiento y preparación de reactivos apropiada. ADN debe ser extraído de los 5 rollos FFPE. Realizar todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente (15-25 ° C).

3. QPCR para CMV

1. Reacción en Cadena de la Polimerasa Procedimiento (PCR)
   1. Generar una hoja de cálculo Excel de PCR para el ensayo de ejecución CMV. Esta hoja de cálculo Excel calcula la cantidad total de cada reactivo necesario para constituir la mezcla principal con Mg. Se multiplica la cantidad de cada reactivo necesario por muestra (enumerados a continuación) veces el número de muestras y controles más uno (para compensar la pérdida debido a la pipeteo).
      1. Incluir los siguientes reactivos en cada reacción de PCR en la cantidad que se indican:
         Reactivo0; Cantidad por la muestra
         Mix master LC CMV viales 12,5 l
         Mg solución amarillo vial 2,5 l
         Volumen total 15,0 l
   2. Incluir en cada ensayo, ejecute un agua o ningún control de destino (NTC), control negativo, control positivo bajo, un alto control positivo, y, o bien QS3 o QS4, y todas las muestras de pacientes. Los capilares deben establecerse en este orden.
   3. Obtener el bloque de enfriamiento específica para el instrumento de PCR en tiempo real que se almacena a 4 ° C. Colocar los tubos capilares apropiados en el bloque de refrigeración. No toque la superficie de los tubos capilares. Siempre use guantes al manipular los capilares.
   4. Configure todas las reacciones en cadena de la polimerasa en una campana limpia no contaminada con la producción de amplificaciónts.
      1. Retire el número correcto de los viales principales del kit de PCR para probar todas las muestras de los pacientes, además de 5 controles. Deje los viales principales, solución de Mg y PCR grado descongelamiento en agua en el bloque de refrigeración. Cada vial principal contiene suficientes reactivos para 12 pruebas.
      2. Agite suavemente los viales principales y rápido hacerlos girar en la centrífuga a la máxima velocidad.
      3. Combine el contenido de cada vial principal en un vial y agite suavemente de nuevo.
      4. Combine la mezcla maestra y la solución de Mg en las cantidades indicadas en la hoja de PCR en un tubo de microcentrífuga estéril individual.
      5. Mezclar suavemente y alícuota de 15 l de mezcla maestra con Mg en cada tubo capilar, excepto el capilar en la posición 5, que es para el estándar de cuantificación (QS).
   5. Mueva el bloque de refrigeración que contienen los tubos capilares y maestro de la mezcla con Mg de la campana limpia a una campana de procesamiento.
   6. Añadir 2 l de control interno (CI) a los restantes 30 l de mastermezclar con Mg. Mezclar suavemente y alícuota de 15 l en el capilar en la posición 5 (posición para el QS).
   7. De pipeta 10 l de agua, control de ADN, o ADN de la muestra en el tubo capilar apropiado. Tape los tubos capilares utilizando la herramienta de nivelación.
   8. Tome de refrigeración de bloque / muestras al instrumento de PCR en tiempo real.
2. Programar el tiempo real de instrumentos PCR (véase la Tabla 1)
3. La amplificación y la detección realizada en el instrumento de PCR en tiempo real
   1. Inicie sesión en el ordenador
   2. Doble clic en el icono de instrumento e iniciar sesión en el software.
   3. Encienda el instrumento de PCR en tiempo real
   4. Haga clic en "CMV / EBV" en la pantalla frontal.
   5. Siga las instrucciones del asistente de macro.
   6. Seleccione la casilla para ejecutar una auto-prueba cuando lo solicite el software. Un auto-prueba debe realizarse una vez al día el instrumento está en uso.
   7. Nombre de la carrera.
   8. Ajuste el recuento de muestras ubicado en el lef superiort esquina de la página a la suma de los controles y los pacientes incluidos en el período previo e introduzca el número de identificación de cada muestra.
   9. Haga clic en la pestaña "Abs Quant".
   10. En "Tipo de muestra", asigne el tipo de muestra adecuado para el estándar.
   11. Escriba las concentraciones esperadas para el estándar de cuantificación (QS).
   12. Retire los tubos capilares del bloque refrigerador y colocarlos en la posición correspondiente en el carrusel (refrigeración del bloque de la muestra # 1 debe colocarse en la posición # 1 en el carrusel, etc.)
   13. Coloque el carrusel en centrifugar y pulse inicio del instrumento.
   14. Abra centrífuga y quitar el carrusel.
   15. Coloque el carrusel en el instrumento de PCR en tiempo real. Cierre la tapa.
   16. Pulse el botón "Ejecutar".
   17. El instrumento de PCR en tiempo real comprobará cada posición para una muestra. No te alejes del instrumento hasta que este control se ha completado, espetodo si uno de los capilares no es en el carrusel. El instrumento en cuenta esto y preguntar si la carrera se va a continuar. Conteste sí antes de salir.
   18. Una vez que el plazo se haya completado, cierre el informe que se ha generado.
   19. Haga clic en "Absolute cuantificación".
   20. Haga clic en la flecha situada junto a Color de Compensación.
   21. Haga clic en "Seleccionar color de Compensación" en el cuadro desplegable.
   22. Elija el archivo de compensación de color más actual para aplicar a la carrera.
   23. Haga clic en Aceptar cuando la caja se abre.
   24. Haga clic en la flecha de la curva estándar.
   25. Seleccione "uso externo" en el menú desplegable.
   26. Seleccione el archivo de curva estándar externa más reciente, haga clic en Aceptar.
   27. Mire cada curva en el menú absoluta cuantificación para garantizar que las curvas están presentes y no la línea plana, si se asigna una concentración. La cuantificación absoluta para el 705/Back 530 se analiza de forma automática.
4. QuControl alidad
   1. Generar una nueva curva estándar cada vez que se recibe un nuevo número de lote de reactivos, o cada seis meses, lo que es más frecuente.
   2. Añadir 10 l de cada norma a la mezcla principal con Mg. Tenga en cuenta las normas que se incluyen con el kit como el ADN extraído previamente.
   3. Añadir 1 l de control interno para cada estándar a la mezcla principal con Mg usado en la generación de la curva estándar con el fin de asegurar la cuantificación exacta. No agregue IC a la mezcla principal con Mg para el Control Template No (NTC).
   4. Preparar una NTC y tres repeticiones de cuantificación Normas QS 4, 3, 2, 1, y una dilución 1:10 de QS4 para la ejecución para generar la curva estándar, con un total de 16 puntos de datos.
   5. Seleccione "reproduce las directrices" en el menú desplegable para las normas repetidas
   6. Elija el canal ninguno 530/back y encienda la compensación de color cuando se analiza la carrera,
   7. En "Curva Estándar (En ejecución)", seleccione "guardar como exinterno "y el nombre de la curva. Introduzca el comentario "aplicado como curva estándar" al guardar.
   8. Representa gráficamente los resultados. El coeficiente de linealidad resultante debe ser ≥ 0,81.
   9. Para tiradas diarias, incluya una copia de QS3 o QS4 como control en la carrera. La curva de corriente estándar externo se puede importar a la carrera durante la fase de análisis.
   10. Ejecutar controles: sin control de ADN, control negativo, bajos, y controles positivos altos. Carga viral esperado se determina y se ajusta para cada proveedor y número de lote.
   11. Añadir un IC a cada muestra y control durante la extracción de ADN.
   12. Si cualquiera de los controles caen fuera de rango, registre los resultados inaceptables y referir el ensayo para la solución de problemas.
5. Frecuencia de los controles
   1. Incluir en cada carrera: a NTC, positivo alto, y el nivel de control negativo, positivo bajo,.

NOTA: Los límites aceptables para los controles. Sin picos se deben observard para el sin plantilla (NTC) y controles negativos. Los picos deben estar presentes en el canal 530 y una carga viral esperados son determinados y ajustados para cada proveedor y el número de lote de los controles positivos bajos y altos.

Resultados

Un total de 228 bloques de tejido fueron probados por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR), que se compone de 91 citomegalovirus (CMV) casos positivos sobre la base de la histología e inmunohistoquímica positiva (IHC), 18 con equívoca CMV IHC, y 79 controles negativos. Como se ilustra en la Figura 2, los casos de CMV positivos se han demostrado inclusiones típicas de CMV virales (A) y / o tinción IHC positivo (B). Casos dudosos se han demostrado pa...

Discusión

Muchos métodos de laboratorio están disponibles para el diagnóstico de la infección por citomegalovirus (CMV), incluyendo serología, el cultivo viral, los ensayos moleculares de viremia, la histología de las biopsias, y, como se ha demostrado recientemente, ensayos moleculares de fijado en formol (FFPE) biopsia incluido en parafina ^5,6 tejido. Serología, una vez a la base del diagnóstico, sólo identifica fiablemente la exposición y no se correlaciona bien con la infección aguda por citomegalovirus ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microfuge tubes	Costar	3620
serrated forceps	Electron Microscopy Services	62086-1S	Micro Forceps MF-1
Tabletop centrifuges (microfuge)	Eppendorf	5424
Xylene	Fisher	Fisher Scientific: X3P	1 gallon
Ethanol	Fisher	Fisher Scientific: ET108	96-100%
microtome	Leica	RM2255
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit	Qiagen	56404
artus CMV LightCycler PCR ASR	Qiagen	4500025
CMV LC PCR Supplement Kit	Qiagen	1031873
LightCycler centrifuge	Roche	75005087
LightCycler Cooling Block	Roche	10800058001
LightCycler Capping Tool	Roche	3357317
Color Compensation Kit	Roche	2158850
LightCycler 20 μL Capillaries	Roche	1 909 339
blades	Sakura	Fisher Scientific: 4689	Accu-Edge low profile