浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

要約

細胞の浸透水透過係数（P _fは ）測定することは、アクアポリンの調節機構（AQPs）を理解するのに役立ちます。ここに提示球状植物細胞プロトプラストにおけるP _fの決定は、プロトプラストの単離および一定の浴潅流の間の浸透圧のチャレンジの結果としての体積変化のそれらの初期速度の数値解析を伴う。

要約

AQP調節機構を研究することは、細胞および全植物の両方のレベルでの水関係の理解のために重要である。ここで紹介するようなカエル卵母細胞などの他の球状の細胞にも原理的に適用可能な植物プロトプラストにおける浸透水透過係数（P _fを ）決定するための簡単かつ非常に効率的な方法です。アッセイの最初のステップは、適切な等張液と室内への酵素的消化により関心対象の植物組織からのプロトプラストの単離である。第二段階は、浸透圧の挑戦アッセイで構成されています。室の底に固定化されたプロトプラストは、等張液で始まる定数灌流に提出し、低張液が続いている。細胞膨張は、ビデオ記録される。第三のステップでは、画像は体積変化を得るために、オフライン処理され、体積変化の時間経過をosmola変化の時間経過と相関しているチャンバ灌流培地のrity、P _fで得た、Matlabの（ 'PfFit'）で記述された曲線当てはめ手順を使用する。

概要

水の取り込みと細胞膜を横切って流れるが、細胞および全植物の両方のレベルでの植物の存在の基本的な要件です。細胞レベルでは、アクアポリン（AQPs）は、細胞膜^1-3の浸透水透過係数（P _fの ）の調節において重要な役割を果たす。

現在までに、いくつかの方法は、異なる植物器官からのプロトプラストの_fを内因Pを測定するために採用されている（ すなわち 、根、葉、内皮、 等 、ショーモンらによって概説^4）。 P _fを測定するためのアプローチの一つは、浸透チャレンジにプロトプラストを露出させるために、その体積変化（ すなわち 、体積変化の初期の線形位相の傾き）の初期速度を監視することである。二つの異なる方法が以前に両方の溶液の瞬間的な交換に基づいて、このアプローチに基づいて説明した。最初のものはimmobilizで構成されてい吸引マイクロピペットでプロトプラストをると溶液流⁵とマイクロピペット^6を使用して別の溶液からプロトプラストを転送する第1の切り替え。高速の溶液交換の非常に開始時の画像取得を可能にするこれらのマイクロピペット吸引マイクロピペットの転送方法は、可能性が高いプロトプラストへの物理的なストレスを伴う、（体積変化の早い直線位相を捕捉する）と、特殊な装置や専門家のマイクロマニピュレーションを必要とします。

ここで説明する方法はマイクロマニピュレーションを伴わない浴潅流が瞬間的でない場合、P _fの導出を可能にし、細胞への障害を最小限に抑えることができます。

酵素消化の後、等張液に沈めプロトプラストは、電荷相互作用によってプレキシガラス（別名ルーサイトまたはパースペックス）チャンバーのカバースリップガラスの底に固定化される。その後、一定の入浴灌流の間に、等張液をプロトプラストに低浸透圧の挑戦を生成する低張液によって洗い流されている。プロトプラストの膨潤は、映像を記録した後、浴灌流の時間経過および細胞膨潤の時間経過に関する情報を組み合わせることにより、P _fは画像処理及び曲線適合手順によって決定される。

この方法の利点は、実験は非常に効率的であること、それが単一のアッセイにおいて同時に少数の細胞を監視することが可能であり、それは特別な機器や特定のマイクロマニピュレーション技術を必要としないこと、すなわち 。この方法のためのいくつかの応用が可能である。例えば、このような葉肉などの異なる組織や植物由来の細胞のさまざまなネイティブのP _fの決定とシロイヌナズナの葉^7、トウモロコシの葉の葉肉や根皮質細胞^8-10または懸濁液培養細胞^11,12から鞘細胞をバンドル。 additiでに、そのような卵母細胞¹¹のような球状の動物細胞のP _fはを決定することが可能である。 P _fに貢献すると決意;もう一つの例は、プロトプラスト（ 例えば 、キナーゼの遺伝子またはいずれかの他の遺伝子に影響を与える場合があります）でのそれらの遺伝子の一過性発現によりAQP活動の検討を必要とする。例えば、トマトAQP SlTIP2の発現; PEG変換と決定SlTIP2によるシロイヌナズナ葉肉プロトプラストにおける2; 2関連P ¹³ _F。最後に、溶液に添加異なる分子/物質（薬物、ホルモンなど）の_fを Pに対する効果の検討もAQPブロッカーのHgCl ₂ ⁷の例について、調べることができる。

以下のプロトコルは、シロイヌナズナの葉肉細胞とそれらのP _fの決定のプロトプラストの単離を記載している。

プロトコル

溶液の調製

1. 準備等張（600ミリオスモル）及び低張の10mMのKCl、1mMのCaCl _2、およびを含む（500ミリオスモル）ソリューション8 M 2（N-モルホリン） -エタンスルホン酸（MES）、pHが5.7との適切な量の浸透圧を調整するD-ソルビトール：等張および低張液440 mMのための540 mMの。浸透圧計を使用して（目標値の3％以内）の溶液の浸透圧を確認してください。
2. 以下の酵素を含む「酵素ミックス」の乾燥原料の準備：0.55グラムセルラーゼ、0.1グラムのペクトリアーゼ、0.33グラムのポリビニルピロリドンK 30、0.33グラムのBSA（下記表1参照）、ボルテックスにより乾燥粉末を混ぜて、5.7 mgのアリコートを作成し、 -20℃で保存する。

シロイヌナズナ葉肉プロトプラストの単離2。

1. 等張液の約6滴（約30μlの各）でペトリ皿（11センチ）を準備します。
2. ピール背軸（下）シロイヌナズナの葉の表皮、C次いで溶液に触れ、下にさらさ背軸側に降下する等張液に正方形を配置し、約4×4 mm ²で正方形にむいた葉をUT。
3. 、1.5ミリリットルチューブに165μlの等張液中の酵素ミックスの5.7ミリグラム（3.3％w / wで）に溶解し、溶解するまで分程度のためにピペッティングにより穏やかに混合し、同じペトリに酵素溶液を数滴を配置し、同様の一品。
4. 酵素溶液が下がる上に、葉片を移し、パラフィルムの1ラウンドでふたを密封皿を閉じ、20分間インキュベート、28℃に設定した水浴中で料理をフローティング。
5. 皿に等張液のより数滴（各酵素液滴当たり2滴）を追加します。番目のドロップ（酵素液を洗い流す）に、順次、その後、新たな等張液滴に各リーフピースを転送します。ピンセットを用いて、その縁による作品を持ち上げ、プロトプラストを解放する（ティーバッグのような）第二のドロップでそれを振る。1.5ミリリットルチューブにプロトプラスト（切り取ら100μlのピペットチップを使用して）で滴を収集します。

3低張挑戦アッセイ：シロイヌナズナ葉肉細胞膨張

1. 低張液と等張液と別の列と1列を充填することによって灌流システム（ 図1A）を準備します。バルブを開き、すべての方法ダウンインレットマニホールド（ 図1B）にチューブを埋めるために、いくつかの溶液流（第一低張性、そして等張性）とする。トラップされた気泡が存在しないことを確認した後、バルブを閉じます。
2. （; 図1Cに、チャンバの概略図を参照してください。図1B）プレキシガラススライド内チャンバのための底を作るために、シリコングリス（ 表1）を使用して、カバースリップを密封。プロトプラスト、コート用「スティッキー」（グリースリング内カバースリップの上に向けて露出面）をチャンバ底を作ってそれまたはポリ-L-リシン（水中0.1％、 表1）、正の電荷を担持する硫酸プロタミン（ 表1水中1％）を有する。ピペットチップを用いてカバースリップの上、この「糊」を広げ、1を待つ - 2分、3すすぎ - 等張液で4回、残りの溶液を離れて振る。
3. 等張液でチャンバーを埋める。その後、切り取らピペットチップを用いて、チャンバに溶液を含むプロトプラストのドロップを追加し、3待つ - 落ち着くまでプロトプラスト4分。 （下の気泡をトラップ避ける）ソリューション面に触れ透明カバー（ 図1D、1E）とチャンバーカバー。
4. （！チューブ内の気泡に対する保護）灌流システムおよびポンプに接続し、倒立顕微鏡台に（静かに！）スライドを配置し、1ミリリットル/分（より速い速度で一定の灌流のための等張液の流れをオンにする4ml /分）まで、使用することができる。
5. 記録のために体積変化は、倒立顕微鏡は、20X対物レンズとし、PCコンピュータに接続されたCCDビデオカメラで使用されている。選択された不動のプロトプラストの60秒のビデオムービーを記録するためにImageJソフトウェアの「CMU 1394カメラのドライバ 'プラグイン（この二つのソフトウェア片のダウンロードアドレスについて特定の材料の表を参照）を使用してください（おそらく、一番下に貼り付けたもの） 1画像/秒（1Hz）での割合で。 （灌流の開始から合計60秒を完了するために）45秒低張液に切り替え、（これはベースラインを構成している）等張液の15秒洗浄で録音を開始します。 TIF形式のムービーを保存します。注：形状が球形とその最大周長（ 図2A）で十分に焦点を当てた細胞輪郭を持つ：以下の基準を満たす、できるだけ多くの細胞を用いて視野を選択してください。

ImageJのを用いた細胞体積変化4。分析

注：分析するには腫れセルの一連の画像は、「画像エクスプローラ」と（ザビエルDrayeによって書かれた）ImageJソフトウェア¹⁴の「プロトプラストアナライザ」プラグインを使用しています。彼らの最初の時点で選択されたプロトプラストを皮切りに、「プロトプラストアナラ​​イザ」プラグインは自動的にプロトプラストのエッジ（輪郭）を検出し、実験中にその地域の時間経過を計算します（プラグインは以下のPfFit解析プログラムで使用可能です） 。

1. ImageJのを起動します。 「インポート」し、 '画像エクスプローラ」：彼らが展開としてムービーを開くには、連続して、ドロップダウンメニューに、その後、ImageJのパネル上の「ファイル」をクリックします。選択したムービーを強調表示して、それを右クリックして、「プロトプラストアナラ​​イザー」を左クリックします。実験中に大部分が不動のままプロトプラストを識別するために（プロトプラスト画像下部にあるスライダを使用して）、ムービーをブラウズ - これらが分析されます。戻る最初のIMA上GEは、マウスを使用して、その後現れた「検出パラメータ」の表に「OK」をクリックして、選択したプロトプラスト（ 図2B）の周囲（ImageJの描画ツールから採取）の円を描く。
2. プロトプラスト検出アルゴリズムを起動するには、ドロップダウンメニューで、その後、プロトプラスト画像トップパネルの「プロセス」「ローカル」をクリックします。ムービー全体を通して、選択したプロトプラスト（ 図2C）の周りに緑の円を調べます。 Excelファイルの「結果」を保存します。 ImageJのを終了します。注：場合は赤い点が（悪い輪郭フィット感を示すために - 通常不良による画像コントラストに）表示され、異なるパラメータで再実行してください。
3. 各セルに属する系統を分離するには、（ - 2つ以上のセルを同時に分析した場合には - 分析はフレーム毎に行われるため、絡み合っされます）、Excelで、セル番号欄（「オブジェクト」で保存されたデータを並べ替える）。
4. DETEへP _fの真の価値を得るためのピクセル対程度の変換係数をrmine、同じ20X顕微鏡対物レンズを経由してマイクロメートル定規のイメージをスナップ。定規イメージに沿って（ImageJの描画ツールから採取）のラインをドラッグして、ImageJのメインパネルの下部にある定規の長さに相当画素数をお読みください。 Excelファイル内の任意の画素領域の値は、以下²に変換します。テキストフ​​ァイル（数値のみの2列）として（セルごとに個別に）領域の時間経過を保存します。注：これは、ボリュームフィット」PfFit 'プログラムに入力されます。

5。ImageJのとMatlabのプログラムP _Fフィットを使用した実験室内での浸透圧の変化率をモデル化

1. 等張液（ 'インジケーター色素'を生成するために）100mlに2mgのキシレンシアノール（ 表1、以下）を加える。
2. インジケータ色素と非染めhの（3.1のように）灌流システムを準備しますypotonicソリューション。
3. カバースリップ（前プロトプラストと同様に）でそれをカバーし、顕微鏡ステージ上に置き、ゆっくりインジケーター色素で室内を満たし、プレキシガラス室の底部にシリコングリスを使用してカバースリップを密封。
4. 灌流システムとポンプにチャンバーを接続し、リットルml /分で一定灌流のためのインジケーター色素の流れをオンにします。
5. 1Hzの速度で、60秒の動画を記録します。 45秒間の低張液に切り替えて、インジケーター色素の15秒で録画を開始します。撮影を停止します。インジケータ色素（少なくとも30秒間）と面一に、新しいムービーを開始します。 6回、すべての映画を保存する - 約5を繰り返します
6. 変化する透過率の平均化時間経過を得るために、インジケーター色素の透過率のビデオ画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用する。
   1. ImageJのを起動し、「ファイル」、そして、「開く」をクリックして、映画のために参照します。各映画のために、10ピクセル幅の縦型を描く映画の1 ^番目の画像上の任意の場所を矩形。 ImageJのメインパネル上の「イメージ」をクリックし、ドロップダウンメニューで「トリミング」をクリックします。
   2. 「スタック」と「メイクモンタージュ」（列60、行1）：彼らが展開として一列に（60秒ムービーの）60フレームの位置を調整するには、もう一度「イメージ」をクリックしてから、ドロップダウンメニューに連続してクリックします。どこでも画像の行全体に沿って1ピクセルの高水平の矩形を描画し、ImageJのメインパネルで「分析」をクリックし、ドロップダウン·メニューで「プロットプロファイル」をクリックします。注：ウィンドウのモンタージュのプロット '（図示せず）が表示され、透過率データのリストは、そのメニューから開くことができます。映画の各画像は、その10ピクセル幅の四角形、結果的に「タイムベース」に由来する10透過率の値によって、このリストで表現されている（画像連番）が10倍長い。
   3. 透過率のdatのリストをコピーしますExcelファイルへ（動画ごとに1つのリスト）。インジケーター色素のフラッシュのいくつかの映画から得た透過率の時間のコースを平均。 0.1画像連番を乗算して実時間ベースを生成する。テキストフ​​ァイルに平均化され、時間経過（2列）を保存します。注：平均化する前に、必要に応じて、いずれかの不規則性を拒否するように、個別の経時変化をプロットします。映画はインジケーター色素の定常状態の透過率の少なくとも5最後の秒が含まれていることを確認。
7. 浸透圧の時間経過のさまざまなパラメータを計算するためのMatlabのフィッティングプログラムP _Fフィット（「指標フィット」のパネル、 図3）を起動します。 NOTE：浴溶液中の既知の初期および最終濃度に基づいて、解の変化、浸透濃度の時間経過は（指標色素透過率から、今度は、計算された）濃度の経時変化から算出される、ことを仮定同じダイナミクスに従う色素濃度。 P _Fフィットは無料で使用できるプログラムです。 「PfFit_Installer_web.exeは'からダウンロードできます。詳細な説明と定義を持つフィットユーザガイド_「F P P _Fフィットプログラムをユーザに理解するのに役立つ補足ファイルとしてJoveのを介してアクセス可能である。
8. 「インジケータフィット」パネルで、インジケーター色素の透過率（「指標データファイル」、 図3A）の平均時間経過のデータをインポートし、手動で現在の実験パラメータおよびパラメータ'width'と'の初期推定を挿入「インジケーター色素濃度の経時変化を記述した（ 図3B。クリック」t_halfインジケーター色素濃度（実際のデータとフィット、 図4A）の経時変化のプロットを表示するには、ファイル名を指定して実行」、およびモデル化された（計算値）浴の浸透圧（ 図4B）注：AGOODデータにフィットする（推奨： 図3に示した値で始まる）が不可欠である。

6。MatlabのフィッティングプログラムP _{fのフィット}を使用して、P _fを決定

注：真と完璧な浸透圧計¹¹とプロトプラストの挙動に関する基本的な仮定に加えて、P _fの決定は、P _fが P _fのこのダイナミクスは、時間の根底にあることを、時間とともに変化することがあることを前提にかかっている細胞体積変化の過程と、その3つのパラメータは、それを記述するために十分である：Pの_第 （P _fの初期値）、スロープ_Pfを （P _fの線形変化率）とディレイ（浴の開始までの期間を細胞体積の変化開始までのオスモル濃度変化）。異なるモデルは、null値¹¹を含む異なるこれらのパラメータの組み合わせとその値、を含む、試験することができる。 P _{を精製して、これらのパラメータの最適な組み合わせのための適合を検索するF -計算によって-計算された細胞の体積変化¹¹の実験的な時間経過の最も忠実な再現を、今度は、セルの輪郭領域のインポートシリーズから（参照また補足「P fのフィットユーザガイド」）。}

1. 「ボリュームフィット」パネル（ 図5）に切り替えます。インポート用のエリア·データ·ファイル（分析されたプロトプラスト、 図5Aの「地域」の時間経過したテキストファイル）を選択します。パラメータ·ソースとして「最後のインジケータフィッティング」を選択してください（ 図5B;代替案のための「P _fのフィットユーザーガイド」を参照してください）。注：これらのパラメータ（ 図5D）は 、手順を適合ボリューム用浴中の浸透圧の変化を再生するために使用される。
2. 「ボリュームフィット」パネル（ 図5（c））では、（初期化P _fは 、スロープ_Pfのディレイ（推奨：）P _{fのパラメータ}に対する初期推定を埋めるIIで開始し、マーク：それぞれ、1で始まる1、および30）、 'クラス'（推薦モデルを選んだ嵌合する3つのパラメータすべて）のための「チェックする」。 「ファイル名を指定して実行」をクリックし、暫定的な図形（ 図5E）を眼球、必要に応じて、Delayパラメータとレコードの長さを調整します。
3. 適合品質を評価し、フィット感のエラーを記録するために、結果のグラフ（ 図6）調べます。いくつかは、それぞれ倍の初期化パラメータを変更し、「-'Runを再。注：プログラムが動かなくなったときにがっかりしてはいけない - ちょうどプログラムを再起動！
4. フィット誤差の最小値を目指して、初期化パラメータの異なる組み合わせを皮切りに、この手順を数回繰り返します。
5. 画面から直接フィット結果のリストをコピーし、またはTでそれらを見つける彼は「_FIT_Vol_Results.txt 'ファイルを生成されたPfFit。

結果

P _fで決定し、異なるAQPsの活性を比較するために、シロイヌナズナの葉からの葉肉プロトプラストが用いられる。これらのプロトプラストは、低い基底（背景）P _{fはレベル} ^7を有することが見出されたかつ再現P _fの測定を可能にするために機能的な発現系として働くことができる。

6週齢のシロイヌナズナ植物からの成熟葉からプロトプラ...

ディスカッション

ここで説明すると、他の球状の細胞にも原理的に適用可能な単離された植物プロトプラストのP _fを 、 例えば 、カエル卵母細胞^11を測定するための簡単かつ非常に効率的な手順です。この方法は、細胞への浸透性投与に応答して、P _fは測定することに基づいている。このアプローチに基づく他の方法とは対照的に、しかし、浸透圧モル濃度の溶液の変化、 す...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
Plexiglass slide etc.	Perspectiv		http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'.
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK