A Biochip eletroquímica microfluídica à base de Análise de hibridação DNA livre-Label

Resumo

Nós apresentamos um biochip electroquímica à base de microfluidos para a detecção de hibridação de ADN. Após a funcionalização ADNcs sonda, a especificidade, a sensibilidade, e o limite de detecção são estudadas com alvos de ADNcs complementares e não complementares. Os resultados ilustram a influência dos eventos de hibridação de ADN no sistema electroquimico, com um limite de detecção de 3,8 nM.

Resumo

A miniaturização de procedimentos analíticos de bancada para a micro-escala fornece vantagens significativas em relação ao tempo de reacção, o custo, e a integração dos passos de pré-processamento. Utilizando estes dispositivos para a análise de eventos de hibridação de ADN é importante porque oferece uma tecnologia para a avaliação em tempo real dos marcadores no ponto de atendimento para várias doenças. No entanto, quando a pegada dispositivo diminui o domínio de vários aumentos de fenômenos físicos. Estes fenómenos influenciar a precisão de fabrico e a fiabilidade de operação do dispositivo. Portanto, há uma grande necessidade de fabricar e operar com precisão estes dispositivos de uma maneira reprodutível, a fim de melhorar o desempenho global. Aqui, descrevemos os protocolos e os métodos utilizados para a fabricação e operação de um biochip eletroquímica microfluídica à base para a análise precisa de eventos de hibridização DNA. O biochip é composto por duas partes: um chip de microfluidos comtrês micro-canais paralelos feitos de polidimetilsiloxano (PDMS), e um 3 x 3 dispostas electroquímica de micro-chip. Os eventos de hibridização DNA são detectados através da análise de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS). A análise EIS permite variações de monitoramento das propriedades do sistema eletroquímico que são dominantes nessas escalas de comprimento. Com a capacidade de monitorar as alterações de ambos e de transferência de carga com a resistência à difusão do biossensor, que demonstram a selectividade para alvos de ADNcs complementares, calculado um limite de detecção de 3,8 nM, e uma reactividade cruzada de 13% com outro ADNcs não complementar a seguir 20 min de incubação. Esta metodologia pode melhorar o desempenho dos dispositivos miniaturizados por elucidar sobre o comportamento de difusão no regime de micro-escala e por permitir o estudo de eventos de hibridação de ADN.

Introdução

Lab-on-a-chip dispositivos microfluídicos (LOC) oferecem inúmeras vantagens em diagnósticos clínicos, monitoramento ambiental e pesquisa biomédica. Estes dispositivos utilizam canais de microfluidos para controlar o fluxo do fluido às regiões do chip em que uma variedade de processos pode ocorrer incluindo a mistura de reagente, a afinidade de ligação com base, a transdução de sinal, e a cultura de células ^1-4. Microfluídica oferece muitas vantagens sobre as ferramentas de diagnóstico clínicos convencionais, tais como leitores de microplaca ou eletroforéticos testes de desvio de gel. Dispositivos de microfluidos requerem 2 a 3 ordens de magnitude (em oposição nanolitros a microlitros) menos reagentes para efectuar ensaios semelhantes. Além disso, estes dispositivos podem aumentar a velocidade com que alguns eventos biológicos ocorrer devido ao menor confinamento das espécies dentro dos canais ^5,6. Em terceiro lugar, os sensores podem ser integrados dentro de dispositivos microfluídicos usando técnicas de litografia e gravura, que podem fornecer detectio sem rótulon. Finalmente, estes dispositivos são de produção barata e exigem pouco trabalho por parte do técnico para operar ^7-10.

Detecção livre de marcador é tipicamente realizada usando um transdutor óptico ou eléctrico. Dispositivos ópticos podem apresentar um melhor desempenho de detecção devido a menor interferência com analitos presentes na amostra. No entanto, seu desempenho fica comprometida nos casos em que o fundo da amostra tem o mesmo comprimento de onda ressonante como o sensor ^11. Há muitas vantagens em usar sinais elétricos para realizar a detecção biológica e química em sistemas microfluídicos. A fabricação é inerentemente menos complicada, uma vez que estes sensores geralmente requerem apenas eléctrodos padronizados para operar. Além disso, os sinais eléctricos podem ser directamente em interface com a maioria do equipamento de medição, enquanto outras modalidades de sinalização pode exigir um transdutor para converter o sinal de ^12-15. Sensores elétricos comumente medir as mudanças na impedance ^16,17, capacitância ^18, ou redox atividade ^19. No entanto, novos desafios são apresentados como estes sistemas são miniaturizados. Os desafios mais importantes para superar incluem: preparação de amostras e mistura de fluidos (devido ao baixo volume de amostra e número de Reynolds), efeitos físicos e químicos (incluindo forças capilares, rugosidade da superfície, interações químicas entre materiais de construção e analitos), de baixo sinal para-ruído (produzido pela redução da área de superfície e volume) ^20-23, e a interferência potencial de analitos electroactivas em amostras biológicas complexas (por exemplo, de sangue e de saliva). Outras investigações destes efeitos resultarão em diretrizes para uma fabricação precisa e operação destes dispositivos de forma reproduzível que iria melhorar em seu desempenho geral.

A detecção de hibridação de ADN é usado extensivamente para o diagnóstico de doenças genéticas ^24,25 e várias formas de cancer ^26. Todos os anos, várias cepas de influenza são identificados em pacientes que utilizam os resultados de técnicas de hibridização DNA ^27. O vírus da gripe responde sozinho por 36 mil mortes por ano nos Estados Unidos ^28. Tais exemplos poderiam beneficiar de uma bancada dispositivo de microfluidos, que pode executar as mesmas técnicas de teste como um teste de desvio de leitor de placas ou de gel com baixo volume de amostra e a uma fracção do custo, sem sacrificar a sensibilidade ou especificidade. Devido às muitas vantagens da detecção electroquímica livre de marcador, tem sido amplamente utilizado para a detecção de eventos de hibridação de ADN ^29,30. A configuração em que os eléctrodos de macro-escala (na gama de milímetro) são imersas em provetas com a solução de interesse pode ser utilizado para proporcionar dados muito sensíveis em relação à cinética de ligação de sequências de ADN de cadeia simples, que correspondem às suas sequências complementares. Recentemente, tem havido alguns avanços na incorporação de sensor eletroquímico em microfluidics para hibridação de ADN. Estudos têm sido realizados sobre a cinética de hibridização ³¹ e integração de sensores para detecção de ¹⁵ em canais microfluídicos. No entanto, continua a existir a necessidade de um dispositivo de microfluidos de alto rendimento e que pode analisar eventos de hibridação de ADN em paralelo, sem complicados passos de preparação de amostra.

O dispositivo apresentado neste trabalho fornece uma plataforma que permite múltiplas interações para ser exibido em paralelo e sem complicadas etapas de preparação da amostra. Nosso protocolo apresenta como microfluídicos baseados em biochips eletroquímicos são microfabricados com sistemas micro-eletromecânicos (MEMS) ^32,33. Descreve-se o processo de fabricação, tanto o chip de microfluidos, feita de polidimetilsiloxano (PDMS), e o chip de electroquímica, composta por uma matriz de eléctrodos. A funcionalização química do biochip com sondas ssDNA também é abordada. Finalmente, o abildade do biossensor para detectar especificamente e analisar alvos de ADNcs é demonstrada. Em geral, o biochip electroquímica à base de microfluidos é uma técnica rápida e análises de elevado rendimento. Ele pode ser usado para investigar interacções entre moléculas biológicas e realizando transdutores, e pode ser utilizado em uma variedade de aplicações lab-on-a-chip.

Protocolo

1. Microfabricação do chip microfluídico

1. Prepare Eletroquímica Chip
   1. Padrão Ouro Eletrodos
      1. Lavar a 4 'wafer de silício em branco (qualidade prime) com acetona, metanol e isopropanol ("AMI" limpo). Lavar o isopropanol a partir da bolacha com água desionizada (DI), seguida por secagem com _N2 arma.
      2. Crescer uma espessa camada de _SiO2 passivation 1 mícron com deposição química a vapor assistida por plasma (PECVD) ferramenta. Deposite um 200 uma espessa camada de cromo seguido por um 2000 uma espessa camada de ouro com uma ferramenta de sputtering DC.
      3. Girar "PR1" fotossensíveis positivas (parâmetros de giro: 3.000 rpm, 1.000 rpm / seg, 30 seg) para criar uniformes filme ~ 1,6 mm de espessura. Pré-coze a bolacha durante 1 min a 100 ° C sobre uma placa quente.
      4. Expor a pastilha com 190 mJ / cm ² a 405 nm de comprimento de onda através de uma fotomáscara. Desenvolver o wafer durante 30 segundos em 352 developer e lavar o wafer com DI e seque com N ₂ arma.
      5. Grave o ouro com etchant ouro para 1,5 min. Grave o cromo com etchant cromo para ~ 30 segundos. Lavar o wafer com DI e seque com N ₂ arma.
      6. Tira o fotorresiste com "AMI" processo limpo.
         NOTA: oxidante forte e potencialmente explosiva.
      7. Limpar a bolacha com 4: 1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ de mistura ("Piranha" limpo) durante 1 min. Lavar o wafer com DI e seque com N ₂ arma.
   2. Padrão de platina Eletrodos
      1. Girar "PR2" fotossensíveis positivas (parâmetros de giro: 3.000 rpm, 1.000 rpm / seg, 30 seg) para criar uniformes filme ~ 1,4 mm de espessura. Pré-coze a bolacha durante 1 min a 100 ° C sobre uma placa quente.
      2. Expor a pastilha com 30 mJ / cm ² a 405 nm de comprimento de onda através de uma fotomáscara. Cozer a bolacha durante 45 segundos a 125 ° C sobre uma placa quente. Flood expora bolacha com 1.000 mJ / cm ² a 405 nm de comprimento de onda, sem uma fotomáscara. Desenvolver o wafer por 2 min em 6: um desenvolvedor AZ400K e lavar o wafer com DI e seque com N ₂ arma.
      3. Depositar uma camada espessa de 400 Â de titânio seguido por uma camada de espessura de 1,600 Á platina utilizando um sistema de evaporação de feixe de electrões.
      4. Levantar fotorresistente em um banho de acetona ultra-sons durante 5 minutos, seguido por lavagem com acetona e isopropanol. Lavar o wafer com DI e seque com N ₂ arma.
2. Prepare Canais Ensaio
   1. Prepare Mold para os Canais de Ensaio
      1. Lavar a 4 'wafer de silício em branco (qualidade de teste) com "AMI" processo limpo. Lavar a partir de isopropanol com a bolacha DI seguido de secagem com _N2 arma.
      2. Girar "PR3" fotossensíveis negativo (parâmetros de fiação de 2 passos.: Primeiro Passo - 600 rpm, 120 rpm / seg, 10 seg Passo - 1.150 rpm, 383 rpm / seg,27 seg) para criar película uniforme ~ de 100 um de espessura. Pré-coze a bolacha em uma placa quente (parâmetros de cozimento de 2 passos:. Uma etapa - rampa até a temperatura ambiente e 65 ° C a 300 ° C / h e mantenha a temperatura durante 10 minutos Passo 2 - rampa até 95 ° C a 300 ° C / h e temperatura mantida durante 30 min).
      3. Expor o wafer com 2.500 mJ / cm ² a 405 nm de comprimento de onda através de uma fotomáscara. Pós-cozer a bolacha pela elevação de 95 ° C a 300 ° C / hora e mantenha a temperatura por 10 minutos em um prato quente. Desenvolver o wafer durante 10 min em propilenoglicol Monometil Ether Acetate (PGMEA) desenvolvedor. Lavar o wafer com isopropanol e seco com _N2 arma.
   2. Fabricar Canais Ensaio
      1. Prepare a 10: 1 de polidimetilsiloxano (PDMS) mistura (20 g de elastómero, 2 g de agente de cura) e desgaseifique completamente em uma câmara de vácuo durante 20 min.
      2. Definir um cerco ao redor do wafer molde com papel alumínio e despeje lentamente o PDMS não curadosobre o molde.
      3. Coza no molde com o PDMS em um forno de caixa (parâmetros de cozimento de 2 passos:. Uma etapa - 5 minutos rampa até a temperatura ambiente e 80 ° C Passo 2 - manter a 80 ° C durante 17 min).
      4. Ao remover suas PDMS do molde e coloque sobre papel-alumínio. Corte as fichas de ensaio com uma faca cirurgião, definem orifícios com um instrumento de biópsia de perfuração.

2. montar o dispositivo

1. Alinhar manualmente os canais de ensaio PDMS com os eletrodos de trabalho sobre o chip eletroquímica. PDMS adere bem ao chip electroquímica, os canais de vedação e evitando a fuga.
2. Ligue um tubo flexível (OD 0,087 'e 0,015 ID' ') a um cotovelo plástico ou conector em linha reta utilizando um tubo flexível curto como um adaptador (OD 0.1875' e ID 0,0625 ''). Anexar conectores para cada uma das entradas perfurados no dispositivo.
3. Conectar uma seringa sobre a outra extremidade doo tubo e colocar a seringa numa bomba de seringa. Alternadamente alterar o conjunto de uma seringa, um tubo e um conector de acordo com a etapa do procedimento referida no ponto 3 e sua solução correspondente.

3 Analisar DNA Hybridization

NOTA: Introduzir cada solução lentamente para dentro do canal, a uma taxa de fluxo de 200 mL / h até que todo o canal é cheio.

1. Funcionalizar cada microcanal vertical com uma sequência de sonda diferente ADNcs (em paralelo para realizar as três microcanais verticais separadas):
   1. Encher cada um microcanal com uma solução diferente, a incubação da sonda de ADNcs (10 mM de tampão fosfato, 100 mM de NaCl, 10 uM de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), e uma sonda de ADNcs uM), e incuba-se durante 1 h, seguido por lavagem do microcanal com PBS.
   2. Encher os microcanais com uma solução contendo 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) num tampão de PBS 10 mM, NaCl 100 mM e 1,395 mM de TCEP, e INCUbate durante 1 hora, seguido por lavagem com PBS do microcanal.
2. Levante os PDMS, girar 90 ° para uma orientação horizontal, e coloque para baixo para expor as linhas separadas de câmaras de reação com cada linha contendo um contador único e eletrodo de referência (Figura S1).
3. Encher os microcanais com solução de medição de controle de 4x de citrato de sódio salino-tampão (SSC) concentrada, e incubar durante 20 min.
4. Medição de fundo: Preencha os microcanais com 5 mM ferricianeto / 5 mM ferrocianeto em solução PBS e registre os valores de impedância do sistema eletroquímico para diferentes freqüências (espectroscopia de impedância eletroquímica; EIS) usando um potenciostato ligado ao trabalho, contador, e eletrodos de referência ( EIS parâmetros: faixa de freqüência de 1 MHz a 0,1 Hz, 10 pontos de dados de frequência por década, 25 mV de amplitude, 5 mV de polarização em relação ao eletrodo de referência). Repita esta medição para cada eletrodo de trabalho nos microcanais.
5. Meça hibridização DNA (executar para cada alvo não complementar e complementar ssDNA).
   1. Encher os microcanais com solução de medição de ADNss alvo concentrada 4x SSC tampão contendo 1 uM de o alvo de ADNcs, e incubar durante 20 min. Medir o ADN de acordo com a etapa 3.4.

Resultados

Um processo de fabricação controlado e preciso para o dispositivo experimental é essencial para a investigação. Ela permite ao pesquisador obter experimentos reprodutíveis rendimento e alta. Aqui demonstramos um rendimento elevado, o processo de microfabricação alta reprodutibilidade de um biochip electroquímica microfluidos-base (Figura 1). Com uma taxa de falha baixa, alguns dispositivos têm mostrado problemas de ligação que conduzem a fugas de solução. De modo a validar a actividade ele...

Discussão

Nossos procedimentos demonstram a fabricação de um biochip eletroquímico baseado em microfluídica e sua utilização para a análise de eventos de hibridização DNA. Através de um processo de alto rendimento microfabricação controlada desenvolvemos um dispositivo composto por canais em microescala integrados com uma matriz de transdutores electroquímicos. Nós planejamos parâmetros de processamento controlados para o procedimento de fotolitografia do chip eletroquímica eo molde canal microfluídicos através ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Material
4'' Silicon wafer	Ultrasil	4-5664	Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm*cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1")	Microchem		positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2")	Hoechst Celanse		positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3")	Microchem		negative photoresist
Gold etchant	Transene	TFA	No dilution
Chromium etchant	Transene	1020AC	No dilution
PDMS elastomer	Dow Corning	3097366 1004
PDMS curing agent	Dow Corning	3097358 1004
Biopsy punching tool	Healthlink	BP20
Tygon flexible tubing	Cole Parmer	R 3603	.015"
Tygon flexible adapter	Cole Parmer	06417-41	.0625"
1 mL syringe	Beckton-Dickenson	301025
Monobasic potassium phosphate	Fluka	1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Sigma	RES20765-A7
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Aldrich	C4706
6-mercapto-1-hexanol	Aldrich	451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer	Sigma	93017
Potassium hexacyanoferrate(III)	Aldrich	455946
Sodium ferrocyanide	Aldrich	CDS001589
Target ssDNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/AAAGCTCCGATAGCGCTCCG TGGACGTCCC-3’
Complementary ssDNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)	Oxford Instruments	PlasmaLab System 100	Chamber pressure 1000 mTorr, Tempreture 200 celsius degrees, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Angstrom/minute.
DC sputtering unit	AJA International	ATC 1800-V	For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system	Denton	Custom-built	For Titanium: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Angstrom/second. For Platinum: Chamber pressure <2E-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5k W, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Angstrom/second.
Potentiostat	CH Instruments	660D
Syringe pump	KD Scientific	KDS230