永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

要約

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

要約

科学の進歩のペースが急速に加速してして、新たな方法を迅速かつ簡単にマウス脳における遺伝子発現を操作するために実験的な神経科学のために必要とされる。ここでは、最初の新生児マウスの脳内へのウイルスによりコード導入遺伝子の直接の頭蓋内送達のためにPassiniとウルフによって導入された技術について説明します。最も基本的な形態では、手順は、アイスバケットとマイクロリットルシリンジを必要とします。しかし、プロトコルは、技術の新たな研究者のための一貫性を改善するために、定位固定フレームとの使用に適合させることができる。この方法は、上衣ライニングは、出生後の最初の12〜24時間の間、まだ未熟である間脳実質への脳室から自由に移動するためのアデノ随伴ウイルス（AAV）の能力に依存しています。脳全体の神経細胞の広範な伝達におけるこの年齢の結果でのAAVの室内注射。発現は、注射の日以内に始まり、lifetim持続動物のメール。蛍光タンパク質の共発現は、形質導入細胞の重要なラベルを提供しながら、ウイルス力価は、形質導入されたニューロンの密度を制御するように調節することができる。既製の両方を提供するために、ウイルスコア施設、事前包装された試薬およびカスタムウイルス調製物の立ち上がり可用性と、このアプローチは、迅速、簡単、かつはるかに安価であるマウス脳における遺伝子発現を操作するためのタイムリーな方法を提供伝統的な生殖細胞工学より。

概要

神経遺伝子発現を改変するための従来の方法は時間がかかり、高価な生殖系列操作を必要とする。そのような子宮内エレクトロポレーションまたは定位レンチウイルス注入収量のように新たにアプローチより速く結果オルタナティブかつ低コストであるが、複雑な外科的介入^1-3必要とするという欠点を持っている。さらに、導入遺伝子の発現は、これらの方法に制限された空間範囲を有する。本明細書では、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルス（AAV）の脳室内注射を介して広範な神経細胞操作のための、迅速、簡単、かつ経済的な方法を記載する。方法はまず^、AAVは、それが未成熟上衣障壁を通って脳実質⁴に側脳室からの経過とともにそれは脳脊髄液内に拡散させてから、それらが小さな粒径を示唆2001年にジョン·ウルフとマルコPassiniによって記述された^5。 F内のAAVの室内注射IRST誕生利回り嗅球から脳幹^6,7に、脳のあらゆる領域に及ぶ神経サブセットの普及ウイルス形質導入後24時間。ウイルスにより配信の導入遺伝子を発現させ、注射日以内にアクティブで、形質導入後の年まで持続している。このように、この多目的な操作は、生後初期の脳の発達から成人老化および変性に至るまでの研究を可能にします。

それはニューロン^6の形質導入で最も効率的であるため、私たちの具体的な実験のニーズに技術を適応では、主にAAV8血清型に焦点を当てている。私たちは、ウイルス力価は、遺伝子操作の細胞固有の影響を試験する実験のために形質導入​​された神経細胞の密度を制御するために希釈することができることを示している。また、2つのウイルスがために選択された血清型に依存して、ニューロンの別個のまたは重複するセットに向けて付勢されている発現パターンを生成するために同時注入することができたことを実証ウイルスパッケージ。私たちの仕事は、実験的な神経科学の設定の広い範囲で使用するためのこの技術の汎用性を拡大する。

プロトコル

実験動物の管理と使用のための健康ガイドの国立研究所に従って動物を含むすべての手続きとプロトコルを実行します。ここで説明する手順を見直し、医療施設内動物管理使用委員会のベイラー医科大学によって承認された。

齧歯類の脳における導入遺伝子の送達のための複製不能アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、生物学的安全性レベル1の使用が承認されている。適切な保護やウイルスの取り扱い手順についての具体的な要件について詳しく説明し、「微生物学および生物医学研究所（BMBL）におけるバイオセーフティ "米国政府の出版のためのCDCのウェブサイトを参照してください。ウイルスを用いた手順のための制度固有の要件を学ぶために地元の獣医と環境安全スタッフに確認してください。手続き室、検疫、およびバイオハザードケージの識別に関する規程は教育機関ごとに異なる​​。

1。前P0仔と養母を削減する

1. すべての妊婦および授乳雌は繁殖および授乳のエ​​ネルギー需要をサポートするために、高脂肪食を提供します。
2. 夜には、単一の居住者の男性のケージに1つまたは2つの健康な女性のを追加して飼育ケージを設置。翌朝は、差込みプラグ用​​のメスをチェックし、プラグが存在する場合には、男性から、女性を分離する。
   1. 貧しい母親の特性（例えば、C57BL / 6またはC3HeJ）との遺伝的背景から子犬を上げるために養母を使用してください。転送子犬が養母自身のごみの4日以内に生まれた場合は、フォスターの母親は、他のゴミから子犬を受け入れる。
   2. メス2組のほぼ同時に配信するように実験的なブリーダーと並んで、ICRまたはFVBメスを使用して個別の交配ケージをセットアップします。
3. 女性はバックグラウンド系統に応じて、プラグ日から19±1日でお届けします。 3日前からd（16日プラグ日以降）eliveryは、新鮮なネスティング材料と覆われた避難所で清潔なケージに妊娠中の女性を配置します。
4. 一日二回出産予定日の2日前（17日プラグ日以降に）開始する新生児のために確認してください。ピンク新生児の存在について、底部を通ってかいま見ることで母親に最小応力とケージを確認します。マウスは、一般的には午後にお届けします午前中が、まれに子犬をお届けします。
5. 子犬、またはいずれか早い方の誕生の6時間内（可視ミルクスポットによって明らかになる）介護されるとすぐに注射を実行するように計画します。

2注射用機器を準備する

1. 一般のP0新生児用32 G針を10μlの注射器を準備します。定位噴射を行う場合は、マニピュレータアームの上にシリンジをマウントします。
2. 注射用の定位フレームを使用している場合、100％のエタンを追加して4-8℃に新生児のステージを冷却オールおよびブロックの先端のリザーバにドライアイス。仔の凍傷を避けるために、1℃以上の温度を維持する。

3注射用のウイルス希釈液を調製する

1. 1％トリパンブルー染料溶液（20×ストック）を準備します。
2. クラス2バイオセーフティキャビネット内にアデノ随伴ウイルス（AAV）株式の5-25μlのアリコートを準備します。将来の使用のために-80℃でこれらの分量を配置します。これはウイルスが形質導入の有効性を失う原因となるような追加の凍結融解は避けてください。
3. 解凍する氷上で-80℃の冷凍庫と場所からのAAVの分量を削除します。
4. 氷冷した1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にウイルスを希釈して注射のためにウイルス溶液を調製する。形質導入パターンの初期最適化のための10倍連続希釈^（10月10日から^8月 10日までのウイルス粒子/半球）から開始します。
5. 0.05％の最終濃度までAAV溶液に20倍のトリパンブルーを追加する。

4。注射用新生児のステージング

1. 冷却するために氷の上の小さなアルミ板を配置します。ドライタスク冷たい金属から子犬の皮膚を保護するために、プレートの上に拭きを置きます。これは子犬を麻酔し、注入するための平坦な冷たい面となっている。
2. 注射の前と後の温かい新生仔マウスを維持するのに適した温暖化パッドを準備します。
3. 新生児の看護師に始まったら、ケージからそれらの約半分を削除し、その母親と一緒に残りの半分を残す。注射を待つ間加温パッド上で収集子犬を置きます。
   注：生物学的な母親が子犬の世話をしない場合は、すぐにケージから全体ゴミを除去し、注入を待つために加温パッド上に子犬を置く。この状況は、C57BL / 6雌とか、貧弱な繁殖特性を持つ他の近交系を持って生まれて最初のごみを生じる可能性がある。この状況では、牛乳のスポットは新生児に表示されません。
4. 低体温麻酔を誘導するために、コールド金属板上に温暖化パッドから1子犬を転送します。子犬が完全に麻酔をかけたになるのを2〜3分待ちます。非常に静かに足を絞ることによって麻酔を確認し、動きや呼吸の不足を監視します。

新生児マウスにAAVの5。注射

1. フリーハンド新生児マウスへのAAVの頭蓋内注射：
   1. 注射器にロード0.05％トリパンブルーで希釈されたAAVの5μlの。
   2. 静かに70％エタノールに浸した綿棒で麻酔をかけた子犬の頭を拭く。
   3. それぞれの目のラムダ縫合糸からの距離の2月5日で、注射部位を特定します。代わりの注射部位は、約0.8〜1ミリメートルを半ラムダとブレグマとの間で、矢状縫合から側方に位置しています。これらのランドマークは、P0で、皮膚を通して見ることができます。
   4. 非毒性実験室ペン注射部位をマークする。
   5. MONIのための目に見えるスケールで注射器を持ち分配され、溶液の量をtoring。
   6. 親指がプランジャのトップに到達できることを確認してください。誤ってウイルスを分配避けるために針を配置しながら、プランジャーから親指を削除します。
   7. アイスバケットに腕をベンチに肘を置くと傾斜させて注入するためのアームをブレースに快適な位置を検索します。
   8. 直接注射器の下に頭を横に子犬を置きます。マークされた注射部位が上に向くように子犬の頭を回し、静かにしっかり開いた手でこの位置を保持する。
   9. 頭蓋骨の表面に垂直な注射器を持ち、約3mmの深さにマークされた注射部位に注射針を挿入します。抵抗は、針が側脳室に浸透したことを示す、わずかに減少するまで、針を注入する。参照が必要な場合は、非毒性メーカー付きの針の先端から3mmをマーク。染料tに基づいて、子犬の大きさと歪みのための注入深さを調整します心室のargeting。
   10. プランジ​​ャが脳に遠くに針を動かすことなく押すことができるように、しっかりと注射器を持ってください。注射は視床に変位すると、ウイルスの拡散が厳しく制限される。
   11. 注射器から分配量を監視しながら、ゆっくりとウイルスを注入することから始めます。各心室に2μlに最大音量を管理します。針が正しい位置にある場合、色素は心室を埋めるために広がっていく。
   12. ゆっくりと針を撤回。
   13. 最初の注射部位は、他の半球を注入する前に閉じるようにします。
       注：複数回同じ部位に注入しないでください。すでに漏れるために注入し、子犬の負傷や死亡の原因とされている針の力ウイルスを再挿入。
   14. 同じ手順を使用して反対側の心室を注入する。
2. 新生仔マウスへのAAVの定位注射：
   1. 0.05％トリパンブルーのintで希釈されたAAVの負荷を5μl定位マニピュレータが保有する注射器O。
   2. 静かに新生児のフレームの耳バーの間子犬の頭を置く。ヘッドはラムダとブレグマの間の線がステージに平行であることをチェックすることにより、Y軸（前から後ろ）にレベルであることを確認してください。ことを耳や目の間の線間の想像線をチェックすることで（左右に）頭をX軸でのレベルであることを確認し、ステージに平行である。
   3. 静かに70％エタノールに浸した綿棒で、麻酔した子犬の頭を拭く。
   4. ラムダ上記注射器を位置決めするために、定位マニピュレータを使用し、XおよびY座標をゼロ。標準P0仔のための（X、Y）=（0.8、1.5）mmの定位腕を移動します。
      注：子犬の大きさと定位座標は、歪みや年齢によって異なる場合があります。側脳室をターゲットにするために、必要に応じて色素の注射に基づいて座標を調整します。
   5. ゆっくりと注射部位に針を下ろします。頭蓋骨の表面は、indはしますENT、その後、針が皮膚を貫通した後に解放する。頭蓋骨が通常の凹形状を回復するまで、針を後退させるが、皮膚下に針のベベルを保つ。ゼロZは、この時点で座標です。
   6. Z = -1.7ミリメートルまで針を挿入し、-1.5 mmまで後退する。
   7. ゆっくりとウイルスを注入します。各半球は溶液2μlまで受け入れることができます。
   8. 注入が完了した後に30〜60秒の場所に注射器を保管した後、ゆっくりと1〜2分間かけて、針を後退させる。
   9. 注射部位のX軸に負の座標を使用して、対側半球に対して繰り返します。
      注：注射のための代替座標は（X、Y、Z）=（0.8、2.0、-1.5）mmで（1.2、1.0、-1.5）mmである。 （0.8、2.0）での最初の注射を行った後、最終的には（0.8、-2.0）、（1.2、1.0）と（1.2、-1.0）に移動する。半球あたり2μlの合計で、各サイトで溶液1μlを注入。レの手順を完了するために、注射の間で迅速に移動します10分を超える秒。

6。ポスト噴射ケア

1. 両半球に注射を完了した後、正常にその体温や皮膚の色戻るまで加温パッドの上に子犬を後ろに置き、子犬が動き始める。
2. 注入された新生児を看護する実母を使用している場合、彼らは通常の移動を回復した後、生物学的な母親に注入された子犬を返します。温暖化パッド上に残っている未注射子犬を置きます。すべてのマウスが注入されるまで、手順を繰り返します。
3. 注入された新生児を看護する里親のお母さんを使用する場合、それらは通常の移動を回復した後に、ケアのために養母に注入されたすべての仔を転送します。
   1. 注入された動物の成功を確実にするために大部分またはケージから養母に所属仔のすべてを削除します。
   2. 養母の子犬と注入された子犬は、同じ目や皮膚の色を持っている場合、彼らがすることができるので、実験室のペンで養母から子犬をマーク後で区別した。
   3. 養母の子犬と注入された子犬と一緒に自分の寝具の一部を配置します。注入された子犬が新しい子犬の受け入れを向上させるために、彼女の生物学的子孫の香りを取得していることを確認してください。
   4. バック養母のケージにのみ注入された子犬を置きます。養母から残っている子犬を間引く。
4. 母親がに出席し、ケージにそれらを配置する10分以内に注入された子犬を看護していることを確認します。母親はこの時間内に子犬を収集しない場合は、別の養母に子犬を転送します。
5. それは、ウイルスを注射した動物が含まれていることを示すためにバイオハザードカードを使ってケージにラベルを付けます。ハウス72時間認定された場所にケージ。
6. 72時間の検疫期間の後、清潔なケージに母と仔（ただし寝具やその他のケージ項目）を転送します。いずれのウイルスに汚染された寝具への露出を避けるために、レベル2のバイオセーフティキャビネット内のこの転送を実行します。 R通常のマウス施設に注入された動物できれいにケージをeturn。
7. 、バイオハザードバッグに汚れたケージを置いてオートクレーブで滅菌した後、飼育ケージに戻します。

7クリーンアップ

1. 将来の使用のために4℃で、残りのウイルス液を配置します。 ^4℃8で保存した場合、ウイルスは、少なくとも2ヶ月間、導入効率を保持します。
2. 脱イオン水中に繰り返さリンスに続いて、2％の漂白剤と注射針と注射器を消毒。
3. 70％エタノールに続いて、2％の漂白剤とワーキングエリアを清掃してください。
4. プラスチック製バイオハザードバッグに入れピペットチップ、チューブ、マスク、手袋を含むすべて使い捨てのアイテムを収集します。現地の法律や制度の方針（ すなわちオートクレーブまたは焼却）で必要とされる廃棄物を処分。

8。イメージングのためのマウスの脳を準備

1. 3-で二酸化炭素の安楽死チャンバ内に注射したマウスを置きます4週間後に注射。適切な安楽死の手順については、施設のガイドラインに従ってください。これは蛍光標識を消光するようホルムアルデヒドで動物を灌流しないでください。
2. 頭蓋骨から脳全体を取り出し、4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で3-12時間、固定します。
3. 凍結保護のため30％ショ糖に固定された脳を転送します。脳が底に沈むまで4℃でインキュベートする。
4. 細かく砕いたドライアイスの入ったバケツを収集します。正中線の下半分に、脳をカットします。凍結し、ドライアイスで脳の半分を埋める。
5. ドライアイスおよび100％エタノールを添加することによりミクロトームステージを冷却する。
6. PBSを用いてダウン正中でステージに脳を固定し、凍結することができます。
7. 凍結スライディングミクロトームを用いて、30〜45ミクロンの厚さで脳の断面。
8. 不凍液（250ミリリットルのグリセロールを300mlのエチレングリコールを500mlの0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4）を含む24ウェルプレートに置き部。カバープレートのWi将来の使用のために-20℃で、第スズ箔とストア。
9. 1-4井戸からのセクションを収集し、PBS中で3回洗う。
10. 顕微鏡スライドとカバーガラスの上のセクションをマウントします。スライドは、暗い場所で乾燥することができます。
11. ネイティブYFPまたはtdTomatoのための適切なフィルタを用いた画像スライドは、ウイルス形質導入パターンを確認します。

結果

成功した脳室内ウイルス注射は、広範かつ強固な神経細胞の表現が得られます。ここでは、YFPまたはニワトリβアクチンプロモーター（CBAプロモーター）の制御下にtdTomatoの蛍光遺伝子を用いてウイルス形質導入を評価した。これらの構築物は、AAV8にパッケージ化および新生児（P0）ICRマウスの側脳室に注入した。高いウイルス力価（半球あたり10 ^10個の粒子）が嗅球、線条体、大脳?...

ディスカッション

私たちは、新生児マウスの脳に広範に送達するためのビヒクルとしてAAVを使用して、ニューロン遺伝子発現を操作するための汎用性の手順を記載している。そのような子宮内電気穿孔¹または定位頭蓋内注射^2,3のように、神経細胞の遺伝子導入する他の方法と比較して、新生児のウイルス注射は、比較的簡単でシンプルです。基本的な手順は、アイスバケット及びマイクロシ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR outbred mice	Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	This strain is also known as CD-1
FVB inbred mice	The Jackson Laboratory	1800	5-6 weeks of age
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
High fat rodent chow	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	This is our standard breeder chow
High fat rodent chow (alternative)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S	If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed
Injection syringe	Hamilton	7653-01	10 ml syringe
Injection needles	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"	32 G, for standard P0 injections
Metal plate for cryoanesthesia	McMaster Carr	8975K439	Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop
Small animal stereotaxic device with digital readout	David Kopf Instruments	Model 940
Universal syringe holder with needle support foot	David Kopf Instruments	Model 1772-F1
Neonatal frame	Stoelting	51625	Officially called a mouse and neonatal rat adaptor
Biohazard disposal bags with sterile indicator	VWR	14220-030	Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal