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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Zusammenfassung

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

Einleitung

Die Aufnahme und Verteilung von Nährstoffen und Schadstoffen stark beeinflussen das Pflanzenwachstum. Dementsprechend ist die Untersuchung der zugrunde liegenden Transportprozesse stellt einen wichtigen Bereich der Forschung in der Pflanzenbiologie und Agrarwissenschaften 1,2, vor allem in den Kontexten der Ernährungsoptimierung und Umweltbelastungen (zB Salzstress, Ammoniumtoxizität). Das wichtigste Verfahren zur Messung von Flussmitteln in Pflanzen ist die Verwendung von Radioisotopen-Tracer, die sich in den 1950er Jahren entwickelt wurde (siehe Beispiel 3) und ist bis heute weit verbreitet. Andere Verfahren, wie die Messung von Nährstoffverarmung aus dem Wurzelmedium und / oder Akkumulation in Geweben, die Verwendung von Ionen-selektiven Mikroschwing wie Mife (Mikro Ionenfluß Schätzung) und SIET (Rasterionenselektive Elektrode Technik), und die Verwendung von Ionen-selektiven Fluoreszenzfarbstoffe, werden ebenfalls häufig verwendet, sind aber in ihrer Fähigkeit, Netz Grippe erkennen begrenztxes (dh die Differenz zwischen Zufluss und Abfluss). Die Verwendung von Radioisotopen, auf der anderen Seite ermöglicht es dem Forscher die einzigartige Fähigkeit, zu isolieren und zu quantifizieren unidirektionalen Flüsse, die verwendet werden können, um die kinetischen Parameter zu lösen (zB K M und V max) und geben einen Einblick in die Fähigkeit, Energetik, Mechanismen und die Regulation von Transportsystemen. Gleichfluss-Messungen mit Radiotracer sind besonders unter Bedingungen, wo der Fluss in die entgegengesetzte Richtung ist hoch nützlich, und der Umsatz von intrazellulären Pools ist schnell 4. Außerdem ermöglichen Radiotracer Methoden Messungen unter relativ hohen Substratkonzentrationen im Gegensatz zu vielen anderen Verfahren durchgeführt werden (siehe "Discussion", unten), weil die zurück Isotop vor dem Hintergrund der anderen Isotop des gleichen Elements beobachtet.

Hier bieten wir detaillierte Schritte für die Radioisotopenmessung von unidirektionalen und net Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffen in intakten Pflanzen. Der Schwerpunkt wird auf die Flussmessung von Kalium (K +), einer Pflanze macronutrient 5 und Ammonium / Ammoniak hergestellt werden (NH 3 / NH 4 +), ein anderes Makronährstoffe, die, wenn sie bei hohen Konzentrationen (beispielsweise vorhanden ist, jedoch giftig, 1- 10 mM) 2. Wir werden die Radioisotope 42 K + (t 1/2 = 12,36 h) und 13 NH 13.03 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), jeweils in intakten Keimlingen der Modellsystem Gerste (Hordeum vulgare L verwenden .), in der Beschreibung der beiden wichtigsten Protokolle: direkte Zustrom (DI) und Kompartment-Analyse durch Tracer-Efflux (CATE). Wir sollten von Anfang an, die in diesem Artikel beschrieben einfach die erforderlich sind, um jedes Protokoll führen Sie die Schritte beachten. Gegebenenfalls werden kurze Erklärungen zu den Berechnungen und Theorie zur Verfügung gestellt, aber detaillierte Darstellungen der einzelnen Verfahren'S Hintergrund und Theorie kann in mehreren wichtigen Artikel über das Thema 4,6-9 gefunden werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle allgemein übertragbar Analyse anderer Nährstoffe / Giftstoffe Strom (zB 24 Na +, Na + 22, 86 Rb +, 13 NO 3 -) und anderen Pflanzenspezies, wenn auch mit einigen Einschränkungen (siehe unten) . Wir betonen auch die Bedeutung, dass alle Forscher, die mit radioaktiven Stoffen muss unter einer Lizenz durch ionisierende Strahlung Sicherheitsregler ihrer Institution angeordnet zu arbeiten.

Protokoll

1. Pflanzen Kultur und Vorbereitung

  1. Wachsen Gerstenkeimlingen hydroponically für 7 Tage in einem klimatisierten Wachstumskammer (Details siehe 10).
    HINWEIS: Es ist wichtig zu prüfen, in Pflanzen bei einer Vielzahl von Entwicklungsstufen, wie Nährstoffbedarf wird mit dem Alter ändern.
  2. Ein Tag vor dem Experiment, bündeln mehrere Sämlinge zusammen, um ein einzelnes Replikat (3 Pflanzen pro Bündel für DI, 6 Pflanzen pro Bündel für CATE) zu machen. Bundle Sämlinge, indem ein 2-cm-Stück Tygon-Schlauch um den basalen Teil der Triebe, und die Sicherung der Schlauch mit Klebeband, um einen "Kragen" zu schaffen.
    HINWEIS: Die Anzahl der Pflanzen pro Bündel kann von den experimentellen Bedingungen 10,13,14 variieren. Bündelung wird getan, um Statistiken und Messgenauigkeit zu verbessern, vor allem, wenn Wurzelmasse und / oder spezifische Aktivität sind gering.

2. Vorbereitung für Experimentelle Lösungen / Materialien

Inhalt "> Hinweis: der folgende wird in der Regel vor dem Experiment 1 durchgeführt Tag.

  1. Für DI, sammeln die folgenden: Pre-Kennzeichnung, Etikettierung, und Desorption Lösungen (für Details siehe 11), Zentrifugenröhrchen (zum Trockenschleudern von Pflanzenproben) und Probenfläschchen (für Pflanzenmaterial und die spezifische Aktivität [S o; siehe unten]). Belüften und mischen alle Lösungen.
  2. Cate, sammeln die folgenden: gut gemischten, Porenbeton Kennzeichnung und Elution Lösungen (für Details siehe 10), Auslauftrichter, Zentrifugenröhrchen (zum Trockenschleudern von Pflanzenproben) und Probenfläschchen (für Eluate, Pflanzenproben und Bestimmung von S o und Verdünnungsfaktor [D f, siehe unten]).

3. Bereiten Radiotracer

ACHTUNG: Die folgenden Sicherheits Schritte sollten vor der Arbeit mit Radioaktivität eingenommen werden.

  1. Stellen Sie sicher, dass die Anforderungen der radiotive Materialien Lizenz verstanden und befolgt werden. Richtige Sicherheitsausrüstung (dh, Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, Blei Weste / Kragen) und Dosimeter (zB TLD-Ring und Abzeichen) zu tragen. Bis Abschirmung gesetzt (dh, Plexiglas und Bleiziegel) und führen radioaktiven Arbeit dahinter. Stellen Sie sicher, dass ein Geiger-Müller-Zähler, um routinemäßig für die Kontaminationsmonitor vorhanden ist.
  2. Herstellung von 42 K +
    1. Legen Sie ein sauberes, trockenes Becherglas auf die Waage. Null das Gleichgewicht.
    2. Entfernen Fläschchen Tracer (20 mCi 42 K 2 CO 3, in Pulverform) aus der Verpackung und gießen Tracer in den Becher. Beachten Sie die Masse.
    3. Pipette 19.93 ml dH 2 O, gefolgt von 0,07 ml H 2 SO 4, in das Becherglas. Dies wird die folgende chemische Reaktion zu fahren:
      42 K 2 CO 3 (S) + H 2 SO 4 (l) + H 2 O (l) → 42 K 2 SO 4 (L) + CO 2 (v) + 2H 2 O (l)
    4. Berechnen der Konzentration des radioaktiven Stammlösung angesichts der Masse und einem Molekulargewicht von K 2 CO 3, und das Volumen (20 ml).
      HINWEIS: Wenn Sie mit 13 NH 13.03 NH 4 + Der Tracer wird in einem Zyklotron über die Protonenbeschuss von dem Sauerstoffatom des Wassers erzeugt (was in der Regel 100-200 mCi Aktivität; Produktions Details siehe 12). Da die Menge der 14 NH 14.03 NH 4 + ist extrem niedrig in diesen Lösungen ist die N-Konzentration der Stammlösung zu vernachlässigen.

4. Direkte Influx (DI) Mess

  1. Für 42 K +, Pipette die Menge der radioaktiven Stammlösung erforderlich, um die gewünschte endgültige Konzentration von K + in die Etikettierungslösung zu erreichen.
    1. 13 NH 13.03 NH 4 +, Pipette eine kleine Menge (<0,5 ml) in die Markierungslösung. Lassen Sie die Markierungslösung gründlich mischen (über Belüftung).
  2. Pipettieren 1 ml Teilstichprobe von Kennzeichnungslösung in ein Probengefäß und wiederholen dreimal (4 Proben insgesamt).
    1. Messen Radioaktivität in Fläschchen (in "counts per minute", cpm), mit einem Gamma-Zähler. Sicherzustellen, daß der Zähler derart programmiert ist, dass cpm Ablesungen für die Isotopen Zerfall korrigiert (dies ist besonders wichtig für solche kurzlebige Tracer).
    2. Berechnen S o (als cpm ausgedrückt mmol -1) durch Mitteln der Zählungen der vier Proben (cpm ml -1) und dividiert durch die Konzentration des Substrats in Lösung (mmol ml -1).
  3. Tauchen Wurzeln in vor-Kennzeichnung (nicht-radioaktive)-Lösung für 5 min vor, ins Gleichgewicht Pflanzen unter Testbedingungen (siehezB 10,13,14 für Variationen in der Vor-Label-Zeit).
  4. Tauchen Wurzeln in der Kennzeichnung (radioaktiv)-Lösung für 5 min.
    HINWEIS: Labeling Zeiten können auf Experiment 3,4,7-10 variieren.
  5. Übertragen Wurzeln Desorptionslösung 5 Sekunden, um den Großteil der Oberfläche haftende Radioaktivität zu entfernen. Übertragen Wurzeln in einem zweiten Becherglas der Desorption Lösung für 5 min auf weitere deutliche Wurzeln der extrazellulären Tracer.
  6. Sezieren und separater Sprossen, basale Triebe und Wurzeln.
  7. Zeigen Wurzeln in Zentrifugenröhrchen und Spin Proben für 30 Sekunden in einem Low-Speed-, klinische-Grade-Zentrifuge (~ 5.000 xg), um Oberfläche und Porenwasser zu entfernen.
  8. Wiegen Wurzeln (Frischgewicht, FW).
  9. Graf Radioaktivität in Pflanzenproben (shoot, basal-Shooting, und die Wurzel, siehe Schritt 4.2.1).
  10. Berechnen Sie den Fluss. Berechnen Zustrom in die Anlage mit Hilfe der Formel
    Φ = Q * / S o Gew L
    wobei Φ die Fluss(Mmol g -1 h -1), Q * die Menge des Tracers im Gewebe angesammelt (cpm, in der Regel in Wurzel, schießen, schießen und basalen, kombiniert), die spezifische Aktivität des Markierungslösung (cpm mmol S o - 1) ist, W die Wurzel-Frischgewicht (g) und t L die Kennzeichnung Zeit (hr).
    HINWEIS: Weitere anspruchsvolle Berechnung kann gemacht werden, um für die gleichzeitige Tracer Efflux aus Wurzeln beim Etikettieren und Desorption ausmachen, basierend auf von CATE erhaltenen Parameter (siehe unten; Details siehe 4).

5. Compartmental Analyse von Tracer Efflux (CATE) Mess

  1. Bereiten Etikettierungslösung und Maßnahme S o (siehe Schritte 4,1-4,2, oben).
  2. Messen Verdünnungsfaktor (D f).
    HINWEIS: Häufig kann die Position der Probe relativ zu dem Detektor im Gamma-Zähler die Menge beeinflussender Strahlung gemessen. Siehe Diskussion für Details.
    1. Nach Messung S o, fügen 19 ml H 2 O zu jeder Probe (wie das Endvolumen = Eluat Volumen = 20 ml). Graf Radioaktivität in jeder 20-ml-Probe (siehe Schritt 4.2.1).
    2. Berechnen D f durch Division der durchschnittlichen cpm der 1-ml-Proben durch den Mittelwert cpm der 20-ml-Proben.
  3. Tauchen Wurzeln in Etikettierungslösung für 1 Stunde.
  4. Entfernen Sie Pflanzen aus Etikettierungslösung und Übertragungsanlagen zu Trichter Auslauf, muss, im Trichter alle Wurzelmaterial ist. Sanft sicheren Pflanzen seitlich Auslauftrichter durch Anlegen einer kleinen Bandstreifen über die Kunststoffkragen.
  5. Gießen Sie vorsichtig das erste Eluat in den Trichter. Timer starten (Hochzählen).
  6. Öffnen Sie die Zapfen zu sammeln und das Eluat in das Probengefäß nach 15 sec (Hinweis: Elutionszeit variieren, siehe unten). Schließen Sie den Hahn. Gießen Sie vorsichtig die nächste Eluat in den Trichter.
  7. Repeat Schritt 5.6 für den Rest der Elution Serie, die folgt von der ersten zu der letzten Eluat: 15 sec (vier Mal), 20 s (dreimal), 30 s (zweimal), 40 s (einmal), 50 sec (einmal), 1 min (25-mal), für eine Gesamtdauer von 29,5 Elution min
    HINWEIS: Desorption Serie kann von den experimentellen Bedingungen 7-10,13,14 variieren.
  8. Sobald Elutionsprotokoll abgeschlossen ist, Ernte Pflanzen (Schritte von 4,6 bis 4,8, oben).
  9. Graf Radioaktivität in Eluaten und Pflanzenproben in der Gamma-Zähler (Multiplikation der Lektüre für jeden Eluat durch D f, siehe 5.2).
  10. Grundstück Tracer Release (cpm g (root FW) -1 min -1) als Funktion der Elutionszeit. Für stationären Bedingungen, führen lineare Regressionen und Berechnungen von Flussmitteln, Halbwertszeiten von Austausch und Poolgrößen (Details siehe 6-9).

Ergebnisse

Figur 1 zeigt Isothermen gefunden unter Verwendung der DI-Technik (13 N) für den Zustrom von NH 3 in die Wurzeln von intakten Gerstenkeimlingen bei hohen gezüchtet (10 mM), NH 4 +, und entweder niedrig (0,02 mm) oder hoch (5 mM ) K +. Die Isothermen angezeigt Michaelis-Menten-Kinetik bei der NH 3 Flüsse in Abhängigkeit von der externen NH 3-Konzentration ([NH 3] ext, durch Änderungen in der Lösung auf pH 1...

Diskussion

Wie in den obigen Beispielen gezeigt, ist der Radiotracer-Methode ein mächtiges Mittel zur Messung der unidirektionalen Flüsse der Nährstoffe und Giftstoffe in der Pflanze. Abbildung 1 zeigt, dass NH 3 Zustrom in über 225 mmol g -1 h -1, das ist vielleicht das ist zu erreichen höchste bona fide Transmembranfluss je in einem Anlagensystem 13 berichtet, aber das Ausmaß dieser Fluss nicht sichtbar sein, wenn nur die Nettoflüsse gemessen w...

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Gamma counterPerkin ElmerModel: Wallac 1480 Wizard 3"
Geiger-Müller counterLudlum Measurements Inc.Model 3 survey meter
400 ml glass beakersVWR89000-206For pre-absorption, absorption, and desorption solutions
Glass funnelVWR89000-466For efflux funnel
Large tubingVWR529297For efflux funnel
Medium tubingVWR684783For bundling
Small tubingVWR63013-541For aeration
Aeration manifoldPenn Plax Air Techvat 5.5To control/distribute pressurized air into solutions
Glass scintillation vialsVWR66022-128For gamma counting
Glass centrifuge tubesVWR47729-576For spin-drying root samples
KimwipesVWR470173-504For spin-drying root samples
Dissecting scissorsVWR470001-828
ForcepsVWR470005-496
Low-speed clinical centrifugeInternational Equipment Co.76466M-4For spin-drying root samples
1 ml pipetteGilsonF144493
10 ml pipetteGilsonF144494
1 ml pipette tipsVWR89079-470
10 ml pipette tipsVWR89087-532
Analytical balanceMettler toledoPB403-S/FACT

Referenzen

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