El ensayo de formación de colonias en agar blando

Resumen

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Resumen

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

Introducción

El ensayo de formación de colonias en agar blando es una técnica ampliamente utilizada para evaluar la transformación celular in vitro. Históricamente, se utilizó otro ensayo, el ensayo clonogénico, descrito por Puck et al. En 1956 para evaluar la capacidad de las células para formar colonias ^1. En esta técnica, las células se dispersaron en una placa de cultivo y se cultivaron en la presencia de células alimentadoras '' o medio acondicionado para proporcionar factores de crecimiento necesarios. La limitación de esta técnica es que sólo se proporciona información con respecto a la formación de colonias. Las células normales se impide el crecimiento independiente de anclaje, debido a un tipo particular de muerte apoptótica, denominado anoikis ^2. Sin embargo, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse sin unirse a un sustrato. Para sacar provecho de este concepto, los investigadores desarrollaron el ensayo de formación de colonias en agar blando. El ensayo de formación de colonias en agar blando desde entonces ha sido modificada, en años más recientes, para abordar specific necesidades. Una variación consiste en la incorporación de colorante fluorométrico para permitir de alto rendimiento recuento de colonias. Otra variación implica el uso de solución especializada agar para permitir la recuperación de células viables después de la formación de colonias cuando se necesitan muestras de proteínas o de ADN.

En el ensayo de formación de colonias en agar blando tradicional, las células se cultivan en una capa de agar blando mezclado con medio de cultivo celular que descansa sobre otra capa de agar blando, también mezclado con medio de cultivo celular, pero que contiene una mayor concentración de agar. Esto evita que las células se adhieran a la placa de cultivo, sin embargo, permite que las células transformadas para formar colonias visibles. El fundamento de esta técnica es que las células normales dependen de contacto célula a la matriz extracelular para ser capaz de crecer y dividirse. Por el contrario, las células transformadas tienen la capacidad de crecer y dividirse independientemente de su entorno. Por lo tanto, las células capaces de formar colonias de una manera independiente de anclaje fueron considered a transformar y cancerígeno. El objetivo general de este método es medir esta capacidad en las células de una manera semi-cuantitativa y rigurosa.

La vía de señalización Wnt es esencial en la embriogénesis y, a menudo reguladas des en la tumorigénesis ^3-6. Hay múltiples vías asociadas con la señalización de Wnt. La vía canónica implica la señalización y la regulación de la transcripción de genes Wnt aguas abajo a través de sus efectos sobre el coactivador transcripcional de beta-catenina. Wnts también la señal a través de varias vías no canónicos, por ejemplo, la vía de la polaridad celular planar, que regula los elementos involucrados en la estructura del citoesqueleto ^7, y de la vía Wnt-calcio, que regula la liberación de calcio desde el retículo endoplásmico ^8. Ligandos Wnt ejercen su actividad a través de unirse a receptores Frizzled. Aunque varios Wnt han demostrado ser upregulated en el cáncer de pulmón, Wnt7a ha demostrado ser regulada en el no-Smalcáncer de pulmón l de células a través de la metilación del promotor ^9. Wnt7a une Fzd9 y actúa como un supresor de tumor a través de una vía no canónica. Restauración de Wnt-7a y Fzd-9 inhibe el crecimiento de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células ^10. Los efectos de la Wnt7a / Fzd9 están mediadas a través de la activación de ERK-5, que a su vez, activa los receptores γ proliferador de peroxisoma activados (PPAR) ^11,12. Aquí, mostramos que la sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 se traduce en la supresión del crecimiento independiente de anclaje de una línea celular de carcinoma de pulmón murino. CMT167 células murinas se derivaron de un carcinoma de pulmón en ratones C57BL / LCRF ¹³ y fueron transfectadas establemente con Wnt7a y Fzd9. La sobreexpresión de Wnt7a y Fzd9 fueron confirmados por PCR cuantitativa (Q-PCR) y la funcionalidad de Wnt7a y Fzd9 sobreexpresión fue confirmada a través de la activación de aguas abajo de PPAR.

Protocolo

1. Preparación de Materiales y Reactivos

1. Etiquetar cada pocillo de un cultivo de tejido tratado placa de 6 pocillos adecuada para cada línea celular o condición objeto de la investigación.
2. Preparar medio de cultivo celular 2x disolviendo 1 g de medio en polvo y 0,2 g de bicarbonato de sodio en agua desionizada hasta un volumen final de 50 ml.
3. Pasar este medio a través de un filtro de 0,2 micras para esterilizar.
4. Añadir componentes adicionales necesarios para el cultivo normal de la línea celular de interés. Por ejemplo, crecer CMT línea 167 de células en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina solución. Medio caliente a 37 ° C en baño de agua caliente antes de su uso.
5. Preparar medio de cultivo celular 1x por separado como si se tratara de la cultura normal de las células de la línea celular de interés.
6. Preparar 1% de agar noble mediante la adición de 1 g de agar noble a 100 ml de agua desionizada.
   NOTA: agar Noble no se disolverá por completo con agitación por sí sola.
7. Preparar0,6% de agar noble mediante la adición de 0,6 g de agar noble a 100 ml de agua desionizada. Ambas soluciones de agar se pueden hacer en botellas de 100 ml de vidrio con tapas de cierre, para su almacenamiento a largo plazo.
8. Autoclave las mezclas de agar nobles para esterilizar. Estas mezclas se pueden hacer de antemano y se almacenan a 4 ° C, pero deben ser calentados de nuevo en el momento del experimento hasta el agar se haya disuelto completamente.
9. Preparar una solución de cloruro de tetrazolio nitroazul haciendo una solución madre de 1 mg / ml en 1X PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, y 0,24 g KH ₂ PO ₄ en H ₂ O hasta un volumen final de 1000 ml ). Esto se utiliza al final del experimento para teñir las colonias.

2. Revestimiento del de la capa inferior de Agar

1. Afloje el tapón de la botella de 1% de agar noble y microondas durante unos 1-2 minutos. Mientras que el calentamiento en un microondas, un seguimiento de la solución cuidadosamente para evitar desborde. Continuar calentando, mientras se mezcla de forma intermitente,agar hasta que se haya disuelto completamente y la solución es clara.
   NOTA: Utilice guantes resistentes al calor para manejar frasco después del calentamiento. Si no lo hace puede provocar quemaduras o lesiones graves.
2. Coloque solución de agar fundido y medio de cultivo 2x pre-calentado en un cubo de hielo llena de agua caliente de la llave (42 ° C). También colocar un tubo cónico de 50 ml en un soporte de tubo en el cubo de hielo con agua caliente. Traslado cubo para campana de cultivo de células para las etapas subsiguientes.
3. Para la capa inferior de agar, necesitará 1,5 ml de una mezcla de agar y medio por pocillo de una placa de 6 pocillos.
4. Para asegurar una cantidad adecuada de la mezcla, preparar un total de 12 ml para cada placa de 6 pocillos.
5. Iniciar mediante la adición de 6 ml de medio de cultivo al tubo cónico de 50 ml y luego 6 ml de la solución de agar noble 1%.
6. Invierta el tubo cónico varias veces para mezclar. Trabajando a un ritmo acelerado impedirá el endurecimiento prematuro del agar blando.
7. Elaborar aproximadamente 5,5 ml de la mezcla en un 5 ml pi serológicapette.
8. Permitir que las burbujas de aire a la altura de la parte superior de la columna de pipeta antes de depositar 1,5 ml de esta mezcla en cada pocillo. Tenga cuidado para evitar la deposición de las burbujas de aire en los pocillos de la placa.
9. Cubrir las placas de agar y permitir que la mezcla se solidifique a temperatura ambiente, en campana de cultivo celular, durante 30 min.

3. Chapado de la capa superior de células que contienen Agar

1. Una vez que la capa inferior de agar se ha solidificado, comenzar la preparación de la capa superior.
2. Primero, las células de la cosecha mediante tripsinización y se les diluyen 1: 5 en medio de cultivo (por ejemplo, para 1 ml de tripsina, añadir 4 ml de medio) en un tubo cónico de 15 ml.
3. Contar las células y calcular el número de células por pocillo necesarios para preparar una suspensión celular final en este momento. Este número variará dependiendo del tipo de célula. Utilice 5.000 células / así como un punto de partida y ajustar según sea necesario. Para este número de células, que le prepare una suspensión celular de 6.667 células / ml (es decir, cada well recibirá 0,75 ml de esta suspensión y 0,75 ml de agar para un volumen total de 1,5 ml; la concentración de células también se diluyó 1: 2 para un recuento final de células total de 5000).
4. El volumen de la suspensión celular necesaria por pocillo de una placa de 6 pocillos será de nuevo 1,5 ml. Preparar suspensión celular adicional por un total de 12 ml por placa de 6 pocillos.
5. Derretir solución de agar 0,6% en un horno de microondas como anteriormente y colocar en el cubo de hielo que contiene agua caliente junto con un tubo cónico de 50 ml en un soporte de tubo y la suspensión celular final de la Etapa 3.3.
6. Transferir el cubo de hielo derretido con 0,6% de agar para campana de cultivo de células para las etapas subsiguientes.
7. Mezclar 0,6% de agar y la suspensión celular en una relación 1: 1, la preparación de un volumen total de 12 ml por placa de 6 pocillos. Se requerirá 1,5 ml por pocillo, pero adicional deben hacerse como anteriormente.
8. Pipetear 6 ml de la suspensión celular en el tubo cónico de 50 ml.
9. A continuación, añadir 6 ml de agar al 0,6% al tubo.
   NOTA: La temperatura de esta mezcla debe sermantenido en torno a los 42 ° C para evitar el endurecimiento prematuro y para maximizar la supervivencia celular.
10. Trabajando rápidamente, pipeta esta mezcla 2-3x para distribuir las células, a continuación, dibuje un 5,5 ml de la mezcla en un 5 ml pipeta serológica.
11. Permita que las burbujas de aire suban a la parte superior de la columna de la pipeta antes de depositar 1,5 ml de esta mezcla en cada pocillo. Tenga cuidado para evitar la deposición de las burbujas de aire en los pocillos de la placa.
12. Deje que la mezcla de células / agar para solidificar a temperatura ambiente, en campana de cultivo celular, durante 30 min antes de colocar en un 37 ° C humidificado incubadora de cultivo celular.
13. El tiempo requerido para la formación de colonias adecuada varía para cada línea celular, típicamente alrededor de 21 días.
14. Una capa de medio de crecimiento debe mantenerse sobre la capa superior de agar para evitar la desecación. 100 l de medio añadido dos veces por semana es suficiente para este propósito.

4. tinción de las placas y contando Colonias

1. Las células de la mancha mediante la adición de 200 _6; l de solución de cloruro de tetrazolio nitroazul por pocillo e incubando las placas durante la noche a 37 ° C.
2. Una vez que las colonias se tiñen, tome fotografías de pozos utilizando un generador de imágenes y cuente las colonias utilizando el software de análisis de imágenes.

Resultados

La expresión de Wnt7a y Fzd9 en CMT167 células es eficaz en la supresión de tumores, como se ilustra por nuestro ensayo de formación de colonias en agar blando. Preliminarmente, se utilizó Q-PCR para demostrar que Wnt7a y Fzd9 ARNm se expresan en niveles bajos en CMT167 células. CMT167 células mostraron bajos niveles de endógeno Wnt7a y Fzd9 cuando se compara con MLE-12 células, un murino línea de células epiteliales de pulmón transformada con SV40 (Figura 1). A continuación, las células t...

Discusión

En confirmación vitro de la función supresora de tumor de las proteínas de señalización es difícil. Uno de los ensayos más rigurosos disponibles para investigar esta propiedad es el ensayo de formación de colonias en agar blando. Aquí, hemos ilustrado el ensayo de formación de colonias en agar suave utilizando una línea celular de carcinoma de pulmón murino de forma estable y que sobreexpresan Wnt7a Fzd9 comparación con su padres línea celular CMT167.

Hay vari...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cancer Cell Line of Interest	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 Cells
Powdered RPMI 1640 Medium	Gibco	31800-089	Used to prepare 2x cell culture medium.
Liquid RPMI 1650 Medium	Cellgro	10-040-CV	Referred to as 1x cell culture medium.
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30910.03	Used to supplement cell culture medium.
Penicillin/Streptomycin	CellGro	30-002-Cl	Used in cell culture medium.
Difco Noble Agar	BD Biosciences	214230	Used to prepare 1.0% and 0.6% agar.
Sodium Bicarbonate	Fisher	BP-328-1	Used in 2x cell culture medium.
Trypsin	Cellgro	25-050-Cl
Sterile Bottle-Top Filters	Fisher	09-761-126	Used to sterile filter 2x medium.
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-020	Used in PPAR-RE luciferase assay.
6-well Plates Tissue-culture Treated
37 °C/5% CO2 Incubator
Chemi-Doc Imager	Bio-Rad		Used to take pictures of colonies.
Quantity One Software	Bio-Rad		Used to count cell colonies.
15 ml Conical Tubes
50 ml Conical Tubes
250 ml Erlenmeyer Flasks
Microwave
5 ml Serological Pipettes
Pipette Aid
Micropipette
Hemacytometer w/ cover slip
Pipette Tips
Inverted Light Microscope
Centrifuge
Heat-Resistant Gloves
Saran Wrap
Ice Bucket