Отбор проб почвы и изоляция энтомопатогенных нематод (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Резюме

Энтомопатогенные нематоды в почве обитающих круглые черви, которые паразитируют широкий спектр насекомых. Мы демонстрируем методы отбора проб, используемые для выделения этих нематод из почвы с помощью двух методов: насекомое травли и модифицированный Белый ловушки, для восстановления нематод из проб почвы и инфицированных трупов насекомых, соответственно.

Аннотация

Энтомопатогенные нематоды (ака EPN) представляют собой группу почвенных обитающих нематод, паразитирующих широкий спектр насекомых. Эти нематоды относятся к двум семействам: Steinernematidae и Heterorhabditidae. До сих пор, более 70 видов не были описаны в Steinernematidae и есть около 20 видов в Heterorhabditidae. Нематоды имеют мутуалистических партнерство с Enterobacteriaceae бактерий и вместе они действуют как мощный инсектицидных комплекса, который убивает широкий спектр видов насекомых.

При этом мы ориентируемся на наиболее распространенных методов, рассмотренных для сбора EPN из почвы. Вторая часть этой презентации основное внимание уделяется технике насекомых-травля, широко используемого подхода для выделения EPN из проб почвы и технике модифицированного Белый ловушки, которая используется для восстановления этих нематод от инфицированных насекомых. Эти методы и способы являются ключевыми шагами для успешного создания EPN культаОЭС в лаборатории, а также стать основой для других биопробы, которые считают эти нематоды в качестве модельных организмов для исследований в других биологических дисциплин. Методы, приведенные в настоящей презентации соответствуют тем, которые выполняются и / или разработаны членами SP фондовой лаборатории, а также те, которые описаны различными авторами.

Введение

Многие нематоды связаны с насекомыми, и принимающими их взаимодействия в диапазоне от выгодно ущерб. При этом мы ориентируемся на группу нематод, которые возбудители насекомых, также известный как энтомопатогенных нематод (или EPN). Две семьи нематод принадлежат к этой группе нематод: Steinernematidae и Heterorhabditidae ^11,13. Их патогенный эффект, на самом деле, предоставляемой их взаимодействия с факультативно-анаэробных кишечных бактерий (Xenorhabdus бактерии связать с steinernematids и Photorhabdus бактерий связывают с heterorhabditids) ^2. Бактерии векторением от одного хозяина насекомых к другому единственной стадии свободной жизни нематод, третьей ступени инфекционного несовершеннолетних (также известный как DauER несовершеннолетнего, инфекционного несовершеннолетнего или IJ), который живет в почве. Оказавшись внутри насекомого, нематоды освободить бактерии в гемолимфе насекомого, которые убивают хозяина насекомых массивными септицемии. Бактерии такжеухудшить ткани насекомого и стать источником пищи нематоды », что позволяет им развиваться и размножаться. Как правило, один или два поколения взрослых нематод производятся внутри трупа насекомых. Потомство последние повторно ассоциирует поколения взрослых с нескольких бактериальных клеток в более специализируются манеру, чем их предыдущий питательной отношений, и развивать эти клетки в кишечнике, как они двигаются из насекомых туши в почву, где они будет ждать еще один насекомое паразитировать ^6,11,14 (рис. 1).

Со времени их открытия в 1927, EPN были рассмотрены ценные альтернативы химических пестицидов, поскольку они могут паразитировать широкий спектр насекомых, которые вредителей сельского хозяйства ^3,4,5. Тем не менее, в течение последних двух десятилетий, эти нематоды и их симбиотические бактерии были признаны как податливый модельной системы для изучения биологических, экологических и эволюционных аспектов хост-микроба ВЗАИМОДЕЙСТВИЕнс ^14.

Целью данной презентации является показать методы и приемы наиболее часто используемые для отбора проб почвы и изоляции EPN. Разнообразные инструменты доступен и может быть использован для сбора образцов грунта в том числе: почвы пробоотборников, мастерки, пост-луночное старателей, шнеки, отбор проб труб, ручные лопаты, среди прочих (рис. 2).

В зависимости от цели исследования, две стратегии выборки можно считать: а) расслаиваются, б) случайная выборка (рис. 3). Стратифицированная выборка обычно используется как часть интенсивного изучения в конкретном или демаркированы области за данный период времени. В общем, разрез в демаркированы и образцы почвы берутся в предусмотренных интервалами в разрезе в течение периода времени (фиг.3А) ^15. Случайная выборка обычно используется при фокусировке на обширной территории. Эта стратегия выборки был использован для изучения разнообразия EPN ером большие географические области или региона (рис. 3В) ^12. Ряд факторов может рассматриваться в зависимости от направленности исследования в том числе разнообразных фасады, почвы текстур и мест обитания (например., Возделанные поля, леса, пастбища, парки, морские побережья, прибрежные районы, и т.д.).

Мы показываем технику насекомых травля, которая была первоначально описанный Постельные принадлежности и Akhurst ¹ и представляет собой простое и избирательное альтернативу для восстановления EPN из образцов почвы. Это отборочной процедурой, которая основана на предпосылке, что нематоды (И.Я. этап) будут привлечены к хосту насекомых и паразитировать его. Этот метод также может рассматриваться для выделения других насекомых патогенов, таких как грибов и бактерий ^8,10.

Мы также демонстрируют технику модифицированный белый ловушки, которая используется для извлечения нематод потомство от зараженных насекомых хостов ^7,14. Это усилий встретилсяХод, который предлагает преимущество получения "чистой" нематод потомство должно быть мусора от унизительных трупов насекомых.

Наконец, способы, описанные и показанные в этой статье соответствуют тем, которые задумал и / или выполняются в нашей лаборатории, а также те, которые описаны различные коллегами и сотрудниками.

протокол

1. Почва Коллекция Образец

1. Рассмотрим охватывающих площадь не менее 2 - 4 м ² для каждого места отбора.
2. Сбор образцов почвы на глубине не менее 15 см (рис. 4).
3. Возьмем по крайней мере 5 случайных выборок в пределах этой области.
4. Принимать 3 подвыборки на образец. В зависимости от цели исследования, либо объединить подвыборки или держать их отдельно.
5. Поместите каждый образец в полиэтиленовый пакет. Рассмотрим двойной упаковки в пакеты, чтобы избежать утечки образцов (рис. 4).
6. Образцы этикеток с водонепроницаемой маркера. Укажите следующую информацию от каждого места отбора: Информация сайта (включая местонахождение / область / имя сайта и GPS координат информацию), дате, среды обитания, связанные растительности, температуры, высоты и т.д.
   Примечание: Если необходимо, собирать и / или записи на наличие насекомых или других беспозвоночных, собранных с образцом для последующей идентификации. Они могут представлять потенциальную Натураль EPN хозяева.
7. Чистые инструменты накопительные между образцами, тщательно промывают водой и / или дезинфекции их с 70% этанола или 0,5%-ного раствора хлорной извести.
8. Держите образцы в более прохладное (8 - 15 ° С) во время транспортировки в лабораторию.
9. Возьмите часть образца грунта для анализа, чтобы получить информацию о составе почвы, текстуры, влаги, электропроводности или других желаемых параметров почвы.

. 2 нематода Изоляция от почвенных образцов: насекомых-травля Техника

1. Удалите весь мусор (т.е.., Скалы, куски дерева или коры, листьев и т.д..) Собраны с вашим образцам, чтобы избежать загрязнения с сапробиотических микроорганизмов.
2. Добавьте воду, чтобы увлажнить почву и облегчить движение нематод.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте распылитель, чтобы постепенно увеличивать уровень влаги в почве.
3. Поместите приблизительно от 200 до 250 мл влажной почвы в чистом пластиковом контейнере с крышкой.
4. Добавить приманки насекомых. Рассмотрим 5 до 10 насекомых на поверхность почвы каждого образца (рис. 5).
5. Накройте емкость крышкой и включить контейнеры с ног на голову.
6. Поддерживайте контейнеры в темноте и при комнатной температуре (обычно 22 - 25 ° C).
7. Проверьте контейнеры каждые 2 - 3 дня и удаления погибших насекомых.
   ПРИМЕЧАНИЕ: добавить дополнительные здоровые насекомых к каждому контейнеру для дальнейшего травле образца грунта.
8. Удалить мертвых насекомых из контейнеров. ПРИМЕЧАНИЕ: Трупы с коричневой или охры окраски обычно паразитирует steinernematids, а кирпично-красный до темно-фиолетового трупов паразитирует на heterorhabditids.
9. Промыть трупы в стерильной воде.
10. Наведите трупы в модифицированном Белого ловушки для восстановления нематод потомства (см. процедуру ниже).

. 3 нематода Восстановление инфицированных трупов: изменения Белый Ловушка

1. Поместите верхнюю часть 50 (или 60) мм в диаметре. Чашка Петри внутри большего блюдо (100 мм).
2. Установите один грехGLE круговой фильтровальная бумага (ватман № 1) внутри меньшего блюдо.
3. Место трупы на фильтровальную бумагу меньшего блюдо убедившись трупы не соприкасаются друг с другом, чтобы избежать загрязнения.
4. Заполните внешнюю (увеличить) чашку Петри с ок. 20 мл стерильной дистиллированной воды. Не добавляйте воду в чашке, которая держит трупы.
5. Накройте большой чашки Петри и его содержимое с крышкой (рис. 6).
6. Этикетка блюда соответственно. Добавить следующую информацию: нематода имя (виды / изолят), дату инфекции (дата инфекция был установлен) и дату ловушки (это дата ловушка устанавливается).
7. Держите ловушку при комнатной температуре, пока не произойдет появление инфекционных несовершеннолетних этапов (IJS). Этот процесс может занять от 10 - 25 дней в зависимости от вида нематод и / или деформации считается.
8. Урожай вода с IJS, удалив большую блюдо ловушку и лить воду с нематодами в стакан.
9. Разрешить нематоды переливать в нижней части BИкер. Этот процесс может занять несколько минут.
10. Налейте тщательно водой так, чтобы нематоды остаются в нижней части стакана.
11. Промыть нематод, добавив больше воды и позволяет нематоды сцеживать. Этот шаг может быть повторен 2 - 3 раза, пока вода не станет чистой.
12. Наведите нематод подвеску в колбу с тканевой культурой (250 мл). Держите концентрацию суспензии до 1000 - 3000 нематоды / мл.
13. Магазин колбу с нематодами подвески в холодном помещении или в инкубаторе между 10 - 20 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: периодически проверять хранящиеся колбы, как срок годности EPN является переменной. Обычно steinernematids могут храниться в течение 6 - 12 месяцев без необходимости субкультивирования, в то время как heterorhabditids может потребоваться больше периодические осмотры.

Результаты

Почва Коллекция Образец

Третьей ступени инфекционные молодь EPN единственные свободные жилые этапы этих нематод жизненного цикла, которые проживают в почве (рис. 1). Поэтому, собирая образцы грунта является очень эффективным методом для восстановления этих нема...

Обсуждение

Эта демонстрация является первым из двух презентаций, описывающих ряд методов, которые обычно используются для изучения EPN и их симбиотические бактерии. Эти методы представляют собой ключевые шаги для успешного создания EPN культур в лаборатории, а также стать основой для других биопро...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	for insect baiting technique
Filter Paper, 55mm Grade 1 Cellulose	Whatman/VWR	28450-048	infection chamber and White trap assembly
60 x 15 mm Petri Dishes	VWR	25384-092	infection chamber and White trap assembly
100 x 15 Petri Dishes	VWR	25384-088	infection chamber and White trap assembly
ZIPloc Plastic Bags	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Mechanical Pipettor P1000, P200 ml	VWR	89130-562; 89130-566	infection chamber and White trap assembly
pippetor tips 1000ml, 200 ml	VWR	16466-004 ; 53510	infection chamber and White trap assembly
Bleach	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
Sodium Hypochlorite	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling , desisnfecting
70% Ethyl alochol	AAPER	17212945	soil sampling , desisnfecting
Shovels	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Tubular soil sampler	Accuproducts	N/A	soil sampling
Soil Probe, long handle	Nupla	PRB4T 69401 Classic	soil sampling
Measuring tape	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
Flagging tape, various colors	Ace Hardware or local hardware store	N/A	soil sampling
tissue culture flasks	VWR	Falcon, 29185-304	White trap, collection of EPN
wash bottles, Polyethylene, Wide Mouth	VWR	16650-107	White trap, collection of EPN