TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati

Riepilogo

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Abstract

Vescicole sinaptiche rilasciano neurotrasmettitori alla sinapsi chimiche attraverso un ciclo dinamico di fusione e di recupero. Monitoraggio attività sinaptica in tempo reale e sezionare le diverse fasi di eso-endocitosi a livello di singolo-vescicole sono fondamentali per la comprensione funzioni sinaptiche in salute e malattia.

Geneticamente codificato sonde pH-sensibili direttamente mirate a vescicole sinaptiche e Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) forniscono la risoluzione spazio-temporale necessario per seguire la dinamica delle vescicole. Il campo evanescente generato per riflessione interna totale può eccitare solo fluorofori collocati in uno strato sottile (<150 nm) sopra il coperchio di vetro su cui le cellule aderiscono, esattamente dove i processi di eso-endocitosi avvengono. Le immagini ad alto contrasto risultanti sono ideali per le vescicole monitoraggio e l'analisi quantitativa di eventi di fusione.

In questo protocollo, SH-SY5Y umano ncellule euroblastoma sono proposti come modello utile per studiare il rilascio dei neurotrasmettitori a livello singolo vescicole da TIRFM, a causa della loro superficie piana e la presenza di vescicole dispersi. Vengono forniti i metodi per la coltivazione SH-SY5Y come cellule aderenti e per loro trasfezione con Synapto-pHluorin, così come la tecnica per effettuare TIRFM e imaging. Infine, una strategia che mira a selezionare, contare e analizzare gli eventi di fusione a livello di cellule intere e single-vescicola è presentato.

Per convalidare l'approccio di analisi procedura di imaging e di dati, le dinamiche di vescicole pHluorin-tag vengono analizzati sotto il riposo e stimolati (depolarizzante concentrazioni di potassio) condizioni. Depolarizzazione della membrana aumenta la frequenza degli eventi di fusione e provoca un aumento parallelo del segnale di fluorescenza netto constatato cellula intera. Analisi singola vescicola rivela modifiche di comportamento fusion-evento (altezza maggiore di picco e larghezza). Questi dati suggeriscono tha depolarizzazione potassio induce non solo un massiccio rilascio di neurotrasmettitore, ma modifica anche il meccanismo di fusione della vescicola e riciclaggio.

Con la sonda fluorescente caso, questa tecnica può essere impiegata in sistemi cellulari diversi per sezionare i meccanismi di secrezione costitutiva e stimolata.

Introduzione

Trasmissione sinaptica chimica tra neuroni è un importante meccanismo di comunicazione nel sistema nervoso. Essa si basa sul rilascio di neurotrasmettitori attraverso un ciclo dinamico di fusione della vescicola e recupero nel sito presinaptico. Molte delle proteine ​​coinvolte nella dinamica vescicole sono stati identificati; tuttavia, il loro contributo specifico al fenomeno resta da chiarire ^1.

La nostra comprensione è in parte limitata dal fatto che i dosaggi più utilizzati per eso / endocitosi non sono sempre la più appropriata. Diversi studi relativi alla fusione delle vescicole e dinamiche si basano su tecniche elettrofisiologiche. Questa tecnica fornisce una risoluzione temporale ottimale ed è eccellente per studiare la fusione iniziale delle vescicole alla membrana plasmatica, ma è in grado di rilevare molti degli eventi molecolari alla base che supportano la funzione presinaptica. La microscopia elettronica, dall'altro lato, fornisce la migliore morphologicaDescrizione l di ogni passo singolare, ma l'aspetto dinamico della manifestazione non può essere catturato, perché i campioni devono essere fissati in modo da analizzare.

L'avvento di nuove tecniche di registrazione ottica ^2,3, in combinazione con i progressi nella fluorescente sviluppo sonde molecolari ^4-6, consente la visualizzazione dei processi di esocitosi in cellule vive, fornendo così nuovi livelli di informazioni sulla struttura e la funzione sinaptica.

Gli studi iniziali sfruttati coloranti attività-dipendente stirilici (FM1-43 e coloranti organici relativi) ^7,8. State-of-the-art tecniche di imaging utilizzano varianti pH-sensibili della proteina verde fluorescente (GFP) (pHluorin) legato alle vescicole luminali proteine ^​​9. Queste sonde sono normalmente spenti quando presenti nelle vescicole a causa del basso pH luminale. Dopo la fusione con la membrana plasmatica, l'interno della vescicola è esposta allo spazio extracellulare neutra, il pH aumenta bruscamente, allevia la tempra protone-dipendente di pHluorin e appare rapidamente il segnale fluorescente. Come la variazione pHluorin è più veloce l'evento di fusione, monitorando aumenti fluorescenza, vescicole fusione con la membrana può essere misurato e analizzato. Poiché molecole pHluorin-tag superficie sono endocitosi, il segnale di fluorescenza successivamente ritorna al livello basale, quindi lo stesso costrutto può anche essere usato per monitorare riciclo ⁹ vescicole.

Mentre il pH-sensore vescicole-tagged assicura la visualizzazione solo di quelle che in realtà vescicole si fondono con la membrana plasmatica, imaging ad alta risoluzione spaziale e temporale è richiesto di descrivere in dettaglio i passi necessari nei processi endocitiche eso /. La tecnica ottico che fornisce la risoluzione spazio-temporale necessaria è riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM), un'applicazione di microscopia a fluorescenza ^10.

"> Riflessione interna totale si verifica all'interfaccia tra il vetro di copertura antiscivolo e il campione. Quando il percorso luce raggiunge il vetro di copertura antiscivolo con un angolo di incidenza maggiore dell'angolo critico, la luce di eccitazione non è trasmesso nel campione, ma è completamente riflessa. In queste condizioni, un evanescenti forme d'onda della luce all'interfaccia e si propaga nel mezzo con meno densità ottica (campione). Come l'intensità del campo evanescente decade esponenzialmente con la distanza dall'interfaccia (con una profondità di penetrazione circa 100 nm) solo i fluorofori in vicinanza vicina alla copertura antiscivolo può essere eccitato mentre quelli più lontani dal confine no. In cellule trasfettate con GFP-costrutti, questa profondità corrisponde a proteine ​​espresse sulla membrana plasmatica o in strutture vescicolari avvicinandosi. Come fluorofori nell'interno delle cellule non possono essere eccitati, la fluorescenza di fondo è ridotto al minimo, e l'immagine con un segnale alto / sfondo ratio si forma ^11.

Diverse caratteristiche rendono TIRFM la tecnica di scelta per il monitoraggio vescicole dinamica. Il contrasto perfetta e l'alto rapporto segnale-rumore rapporto permettono di rilevare segnali molto bassi derivanti dalle singole vescicole. Basato su chip di acquisizione delle immagini in ogni fotogramma fornisce la risoluzione temporale necessario per rilevare i processi altamente dinamici. Infine, l'esposizione minima di cellule a luce in qualsiasi altro aereo nel campione riduce fortemente fototossicità e consente la registrazione lungo time-lapse durata ^12.

L'analisi dei dati rimane l'aspetto più impegnativo e cruciale di questa tecnica. Il modo più semplice per monitorare fusione della vescicola è quello di misurare l'accumulo di proteine ​​reporter fluorescente sulla superficie cellulare, nel tempo ^13. Con l'aumento della fusione, gli aumenti netti segnali di fluorescenza così. Tuttavia, questo metodo può sottostimare il processo, in particolare in grandi cellule ed in condizioni di riposo,perché i processi endocitosi e photobleaching compensare l'aumento di intensità di fluorescenza a causa vescicole esocitosi. Un metodo alternativo è quello di seguire ogni singolo evento di fusione ^14. Quest'ultimo metodo è molto sensibile e può rivelare importanti dettagli circa i meccanismi di fusione. Tuttavia, esso richiede la selezione manuale di singoli eventi, perché procedure completamente automatizzate per seguire vescicole e di registrare la fluttuazione dei loro segnali fluorescenti non sono sempre disponibili. Osservazione delle dinamiche vescicole richiede celle di campionamento ad alta frequenza. Ciò genera una grande quantità di dati che può difficilmente essere analizzati manualmente.

La proposta di questo lavoro è quello di ottimizzare la tecnica di imaging TIRFM per monitorare il basale e rilascio di neurotrasmettitore stimolato nella linea cellulare di neuroblastoma SH-5YSY, e di descrivere, passo-passo, una procedura definita in laboratorio per analizzare i dati, sia a livelli di cellule intere e single-vescicole.

Protocollo

1. Cella Cultura e Transfection

1. Coltura cellulare SH-SY5Y
   NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti con il neuroblastoma umano SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) ^15. Cellule SH-SY5Y crescono come una miscela di ammassi galleggianti e cellule aderenti. Seguire le istruzioni riportate nel protocollo (densità cellulare, rapporto di scissione, ecc.) Per avere cellule che crescono saldamente attaccati alla copertura in vetro, che è cruciale per TIRFM.
   1. Prima di iniziare, sotto l'armadio biosicurezza flusso laminare, rendere il volume opportuno di soluzione di fosfato sterile salina tampone (PBS) e terreno di coltura.
      1. Effettuare 50 ml di PBS con concentrazioni di 150 mM NaCl, 24 mM tampone fosfato, pH 7,4. Filtrare la soluzione.
      2. Effettuare 50 ml di terreno cellulare da Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, siero inattivato al calore fetale bovino 10% (FBS), penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mcg / ml), L-glutammina ( 2 mM), epiruvato di sodio (1 mM). Filtrare la soluzione.
   2. Rimuovere mezzo di crescita completo e lavare le cellule con 3 ml di PBS.
   3. Incubare le cellule con 2 ml di 0,05% tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (per 6 piatto Petri cm) per 5 min a 37 ° C, 5% CO ₂ e staccare cellule usando pipetta.
   4. Inattivare tripsina aggiungendo 2 ml di DMEM, e raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min.
   5. Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 ml di DMEM al pellet e pipetta la soluzione su e giù sufficientemente per disperdere le cellule in una sospensione di cellule singole.
   6. Dividerli 1: 4 in un nuovo diametro Petri piatto 6 centimetri contenente 3 ml di terreno completo. Mantenere le cellule in coltura in 6 centimetri di diametro Petri, a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%. Sub-coltura una volta alla settimana o quando hanno raggiungimento di 80 - 90% della superficie.
2. Placcatura cellule SH-SY5Y per l'imaging
   1. Per gli esperimenti TIRFM, piastracellule su coperture in vetro. Impiegare vetro copre con 0,17 ± 0,005 millimetri di spessore e un indice di rifrazione 1,5255 ± 0,00015. Prima di iniziare, preparare i vetrini come segue:
      1. Vetro Pulire copre con il 90% di etanolo, O / N.
      2. Risciacquare accuratamente in acqua distillata (tre porzioni di acqua distillata). Vetro copre secco in forno.
      3. Luogo copre in vetro di Petri e sterilizzare in forno preriscaldato a 200 ° C per 3 ore.
   2. Il giorno prima transfezione, posizionare ogni coprioggetto in una capsula di Petri 3,5 centimetri, aggiungere 1 ml di terreno di coltura e incubare a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
   3. Trypsinize cellule come descritto ai punti 1.1.3 - 1.1.5, sospendere il pellet in 1 ml di terreno completo e contare. Calcolare il corretto volume di sospensione cellulare per aggiungere a ciascuna piastra di Petri per produrre 3 x 10 ⁵ cellule / pozzetto. È richiesto Questo densità per la crescita cellulare ottimale e trasfezione efficiente. Incubare a 37 ° Cin un incubatore CO ₂ 5% O / N.
3. SH-SY5Ytransfection da polyethylenimine (PEI)
   NOTA: Per visualizzare sinaptiche dinamiche vescicole, è stato utilizzato pCB6 vettore contenente Synapto-pHluorin. Il Synapto-pHluorin è stato generato da telaio in fusione di una variante sensibile al pH della proteina verde fluorescente (GFP) ¹⁶ e la proteina di membrana vescicolare sinaptobrevina 2. Il costrutto è stato ampiamente impiegato per indagare le proprietà vescicole sinaptiche all'interno neuroni ^9.
   1. Prima di iniziare trasfezione, fare 10 ml delle seguenti soluzioni. Conservare le soluzioni massima esempio 1 mese.
      1. Fare una soluzione 150 mM NaCl. Regolare a pH 5.5 con 0,01 N HCl.
      2. Fare una soluzione PEI al 10% polyethylenimine (PEI; 25 kDa lineare) in soluzione di NaCl 150 mm. Il pH della soluzione di sale a 8.8. Regolare il pH a 7,8 con 0,01 N HCl.
   2. 24 ore dopo la placcatura, rimuovere il supporto e aggiornare con 1,5 ml diterreno completo. Conservare le cellule a 37 ° C, in un incubatore CO ₂ 5%.
   3. Sotto il cabinet biosicurezza flusso laminare, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 3 g di plasmide DNA a 25 ml di soluzione di NaCl 150 mm e 100 ml di soluzione di PEI per 3,5 centimetri piastra di Petri.
   4. Vortex per 10 secondi, poi incubare la miscela DNA / PEI per 30 minuti a RT.
   5. Aggiungere con cautela la miscela di DNA / PEI alla piastra di Petri contenente vetrini con le cellule e scuotere delicatamente per distribuire equamente il reagente nella scatola di Petri.
   6. Dopo 4 ore cambiare il supporto e incubare le cellule O / N a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%. Effettuare esperimenti di imaging 24-48 ore dopo la trasfezione.

Imaging 2. Cell di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM)

1. Imaging set-up
   1. Eseguire l'imaging TIRF con il set-up descritto in Figura 1. Esso comprende un motore invertitomicroscopio (figura 1, riquadro A), la sorgente laser (Figura 1, riquadro B) e il TIRF-cursore (figura 1, riquadro C). Raggiungere l'illuminazione TIRFM attraverso un elevato apertura numerica (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) olio 100X, obiettivo ad immersione.
   2. Per illuminazione TIRFM, impiegare un multi-linea (458/488/514 nm) 100 mW argon laser-ion. Utilizzando una fibra in modalità mono, introdurre la luce laser polarizzata linearmente nel percorso ottico, tramite il cursore TIRF. Inserire il cursore TIRF nel piano diaframma di campo luminoso del percorso raggio riflesso di luce.
      1. Per un'ampia illuminazione campo, collegare il microscopio ad un tradizionale lampada al mercurio ad arco corto HBO luce bianca. Un doppio prisma a mantenimento di polarizzazione nel cursore assicura la combinazione simultanea di illuminazione TIRF e luce bianca.
   3. Filtrare la luce laser con un filtro di eccitazione (larghezza di banda 488/10 nm) montato su una ruota del filtro, introdotto nel percorso laser. Impiegaread alta velocità, software-controllato, otturatore per consentire il controllo rapido dell'illuminazione laser. Per l'analisi pHluorin, montare una banda passante del filtro 525/50 nm emissione. Catturare immagini digitali (512 x 512 pixel) in una camera CCD raffreddata veloce con il software immagine ProPlus.
2. Il raggiungimento di illuminazione TIRF (Figura 2)
   1. Accendere i laser, il computer, la macchina fotografica, la ruota del filtro, e dei controllori di scatto; poi, attendere 20 minuti prima di iniziare l'esperimento come i laser hanno bisogno di riscaldarsi e stabilizzarsi.
   2. Prima di imaging, rendere il volume opportune delle seguenti soluzioni.
      1. Effettuare 50 ml di soluzione di Krebs (KRH) a 125 mM NaCl, KCl 5 mM, 1,2 mM MgSO4, 1.2 mM KH ₂ PO _4, 25 mM 4- (2-idrossietil) piperazina-1-acido etansolfonico (HEPES) (tamponi per pH 7,4), 2 mM CaCl _2, e 6 mM di glucosio.
      2. Fare 10 ml di soluzione KCl-KRH (pH 7,4) a NaCl 80 mm, 50 mM KCl, 1.2 MgSO4 mM, 1,2 mm KH ₂ PO ₄, 25 mM HEPES (tamponata a pH 7,4), 2 mM CaCl _2, e 6 mM di glucosio.
   3. Togliere il coperchio di vetro con cellule trasfettate e inserirlo nella camera di imaging appropriata. Montare la camera e aggiungere 500 ml di soluzione KRH nel centro del vetro.
   4. Aggiungere olio sopra l'obiettivo. Posizionare la camera di imaging sul palco del microscopio e posizionare l'obiettivo sotto il vetrino di vetro. Posizionare il coperchio di sicurezza sul campione.
   5. In modalità epifluorescenza, concentrarsi sul vetrino (superficie superiore) e scegliere cellule trasfettate poste al centro della camera. Selezionare le celle cui segnale fluorescente può essere registrato in modo chiaro con un tempo di esposizione al di sotto di 80 msec.
   6. Sotto il controllo del software, passare a illuminazione TIRF in modalità live.
   7. Per impostare la configurazione TIRF, controllare la posizione del raggio che emerge dell'obiettivo, sul coperchio del campione (Figura 2B). Quando il fascio è posizionato nel centro di tegli obiettivo (Figura 2A, a sinistra), un punto è visibile nel centro della copertura del campione TIRF (Figura 2B, sinistra) e la cella viene ripreso in modalità epifluorescenza (più piani fuoco, sfondo elevata fluorescenza; la figura 2C, sinistra) .
   8. Per raggiungere l'angolo critico, spostare il punto focalizzato nella direzione Y (in avanti o all'indietro; la figura 2B, centrale) tramite la vite di regolazione dell'angolo sul cursore TIRF (Figura 1C). Quando il fascio converge sul piano del campione ad un angolo superiore all'angolo critico (Figura 2A, a destra), il punto scompare e diritta, sottile linea concentrata è evidente al centro del coperchio campione (Figura 2B, destra).
   9. Per regolare l'angolo TIRF utilizzare il campione di cellule (Figura 2C). Guarda l'immagine di fluorescenza sul video, in questa fase, una immagine epifluorescenza simile è ancora visibile. Delicatamente, spostare la vite fino TIRF concondizione si ottiene: un solo piano ottico della cella è a fuoco (cioè, la membrana plasmatica a contatto con il coperchio antiscivolo), questo si traduce in un'immagine piatta con elevato contrasto (Figura 2C, destra).
3. Immagini di esempio
   1. Impostare l'esperimento time-lapse singolo canale. Per ridurre al minimo photobleaching, catturare l'immagine utilizzando il minimo di esposizione e ad alto guadagno. Tempi di esposizione adeguati sono tra i 40 - 80 msec. Acquisire le immagini a 1 - 2 Hz frequenza di campionamento. Cinetica vescicole possono essere meglio apprezzato campionamento a frequenza più alta (10 Hz). Il tempo normale di osservazione è di solito 2 min.
   2. Aggiungere 500 ml di soluzione e registrare cellule KRH in modalità TIRFM. Questa è la condizione di riposo. Salvare le immagini sequenziali di tempo.
   3. Focus sulla stessa cella e registrare nelle stesse condizioni di riposo (di potenza laser, tempo di esposizione, numero di telaio). Dopo cinque fotogrammi, aggiungere 500 ml di soluzione di KCl-KRH e mantenere KCl nella camera.Questa è la condizione stimolato; salvare le immagini in sequenza di tempo.

3. Immagine Analisi ed elaborazione dati

NOTA: Per analizzare le immagini, le macro sono state sviluppate in laboratorio, sulla base di funzioni esistenti del software di analisi di immagine; macro simili sono disponibili online (URL fornito in Tabella dei Materiali e attrezzature).

1. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza
   1. Utilizzare una macro "Sequenza intensità di fluorescenza" per la quantificazione intensità di fluorescenza in una regione di interesse (ROI) dell'immagine, nel corso del film.
   2. Aprire le immagini in tempo-sequenziale. Vai al menu macro e selezionare 'Sequence intensità di fluorescenza'. Nella finestra 'Analysis' appare "selezionare il ROI".
   3. Scegli uno degli strumenti di selezione nel menu per creare il ROI. Mettere 3 ROI nelle regioni della membrana cellulare senza macchie (sfondo ROI). Impiegare this "background ROI" per valutare il photobleaching e per impostare la soglia per l'analisi evento di fusione (Figura 3A).
2. Photobleaching correzione e la determinazione della soglia (Figura 3B)
   1. Per valutare il photobleaching, aprire i fluorescenza intensità righe "ROI di fondo", (Figura 3BA). Normalizzare i valori di intensità di fluorescenza in ogni fotogramma al valore intensità iniziale (F0) (F / F0) (Figura 3BB). La media dei valori.
   2. Evidenziare i dati medi e creare un grafico linea utilizzando le opzioni del menu grafico.
   3. Dal menu di analisi dei dati, selezionare "linea di tendenza" per aprire la finestra di analisi trama. Selezionare il tipo di regressione. Impostare regressione "esponenziale". Quindi selezionare "equazione display grafico". Nella finestra del grafico, viene visualizzata l'equazione esponenziale ed i valori dei parametri vengono assegnati automaticamente, (Figura 3BC ).
   4. Applicare la correzione esponenziale per i valori di intensità in ogni fotogramma come segue:
      Fn (corretto) = Fn / exp (-n * a)
      Fn = intensità di fluorescenza sperimentale misurato a telaio n; n = numero di fotogrammi; a = fattore di sbiancamento (costante che esprime il tasso di perdita di intensità a causa di photobleaching;   Figura 3BD).
   5. Per impostare la soglia, aprire un normalizzato e corretto "background ROI", calcolare il segnale media di fluorescenza e la sua deviazione standard (SD). Il valore medio più 3 SD rappresenta la soglia (Figura 3BE). Utilizzare questa soglia per l'analisi dei dati.
3. Selezione di eventi di fusione utilizzando una procedura semiautomatica
   1. Aprire le immagini in tempo-sequenziale con il software di analisi delle immagini. Applicare un filtro gaussiano per la sequenza di immagini attiva.
   2. Analizzare le immagini utilizzando funzione "contare oggetti" o una macro che permette la selezionedi un oggetto la cui pixel hanno intensità media di fluorescenza in un intervallo definito. Impostare l'intensità gamma manualmente, utilizzando la funzione di soglia (andare al menu bar, impostare la soglia misura → per evidenziare l'area di interesse). Una soglia adeguata è del 30% rispetto al segnale di fondo fluorescente locale.
   3. Applicare una macro "Filtri oggetti" per selezionare solo gli oggetti che soddisfano i seguenti criteri:
      1. Applicare l'opzione range (min e max compreso) per aspetto. Aspect riporta il rapporto tra l'asse maggiore e l'asse minore dell'ellisse equivalente all'oggetto. Aspect è sempre ≥1. I valori sono adeguati min = 1, max = 3.
      2. Applicare gli intervalli per il diametro. Diametro riporta la lunghezza media dei diametri misurati a intervalli di due gradi unisce due punti della struttura e passante per il baricentro dell'oggetto. Impostare l'intervallo di pixel (o micron, se si utilizza un sistema calibrato).
      3. Definire il range ottimale in preliminEsperimenti ary: selezionare manualmente i punti di interesse e quindi misurare il loro diametro utilizzando la funzione di profilo trama.
   4. Seleziona "oggetti di visualizzazione": oggetti selezionati appariranno sovrapposte all'immagine TIRFM (Figura 4B).
   5. Includere nell'analisi solo i punti che mostrano una breve (1-3 fotogrammi) transitorio aumento di intensità di fluorescenza, immediatamente seguita da una marcata perdita di segnale (macchie transitorie). Impiegare la selezione circolare per creare un ROI del diametro di circa un punto radialmente attorno alle vescicole / spot selezionati (ROI sperimentale). Eseguire questo passaggio manualmente.
   6. Con le ROI selezionato, calcolare l'intensità media di fluorescenza di ogni ROI nel corso del film.
4. Analisi dei dati (Figura 3C-D)
   1. Esportare il tempo-corso dei cambiamenti fluorescenza misurati in ogni "ROI sperimentale" ad un foglio di calcolo; (Figura 3DA). Normalizzare il valore di intensità in ogni frame per l'intensità iniziale di fluorescenza (F / F0), (Figura 3Db).
   2. Applicare la correzione esponenziale per i valori di intensità in ciascun frame come riportato al punto 3.2.4 (Figura 3Dc).
   3. Per calcolare il numero totale di eventi di fusione (numero di picco), la volta che si verifica ogni fusione (larghezza del picco) e l'ampiezza del picco fluorescente (altezza del picco e AUC) si applicano le funzioni logiche che utilizzano fogli di calcolo o di matematica pacchetti. Un esempio di analisi degli eventi di fusione con formule logiche è riportato in Figura 3DD e 3De.
   4. Assumere l'aumento dell'intensità della fluorescenza supera la soglia (intensità di fluorescenza di fondo media ± 3SD) come fusione delle vescicole alla membrana plasmatica ed il picco risultante come un evento di fusione.
   5. Calcolare la larghezza del picco come differenza tra l'ultimo ed il primo valore x di ogni picco. Moltiplicate questo valore per 1 / (frequenza di campionamento). Considerate questo valore uns il tempo di fusione delle vescicole e l'adesione a livello della membrana plasmatica prima vescicole ri-acidificazione e riciclaggio (Figura 3DD).
   6. Calcolare la AUC whole-cell come una somma di valori sopra soglia. Considerate questo valore come variazione netta fluorescente durante il tempo di registrazione grazie alla spontanea (a riposo) o evocata (stimolato) attività sinaptica.
   7. Calcolare l'altezza di picco come differenza tra il valore y massimo di ciascun picco e la soglia. Considerate questo valore come indicativo del tipo di fusione (singolo vs. fusione sequenziale / simultanea o transitoria vs. completa fusione).

Risultati

Le procedure TIRF imaging e analisi dei dati descritti sono stati concepiti per studiare vescicole dinamiche in sistemi cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare gli effetti di molecole di segnalazione e farmaci sugli eventi di fusione e le dinamiche neurotrasmettitore vescicole ^17. Utilizzando proteine ​​di membrana plasmatica GFP-tagged, l'analisi TIRFM è stato impiegato per caratterizzare il traffico costitutiva di GFP-tagged trasportatori del glutammato in gliali e cellule ...

Discussione

Questo articolo presenta un protocollo di immagine e analizzare vescicole dinamica in cellule secernenti, utilizzando vettori cDNA codificati fluorescenti e TIRFM. Gli elementi chiave del successo di imaging da TIRFM sono la selezione del modello di cellulare e trasfezione delle cellule con indicatori ottici geneticamente codificate di rilascio delle vescicole e riciclo.

TIRFM è ideale per le cellule in crescita aderenti a una copertura in vetro e sufficientemente piatto per permettere la v...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
Multiline Argon Laser Lasos 77	Lasos	00000-1312-752	multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Laser TIRF slider	Zeiss	423681-9901-000	http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x Objective	Zeiss	421190-9900-000	Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394	QImaging		http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter	Sutter Instrument Company		http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Image ProPlus 6.3 Software	Media Cybernetics		spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
Excel	Microsoft		photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/