Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

Riepilogo

Descritto qui è una procedura rapida ed efficace per la ricostituzione funzionale di purificato wild-type e proteina CFTR mutata che preserva l'attività per questo canale del cloro, che è difettoso in fibrosi cistica. Efflusso ioduro da proteoliposomi ricostituiti mediati da CFTR permette studi di attività di canale e gli effetti di piccole molecole.

Abstract

La fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR) è un membro di canali che formano unico della ATP Binding Cassette (ABC) superfamiglia dei trasportatori. L'attività del canale fosforilazione e nucleotide cloruro di dipendenti di CFTR è stato spesso studiato in sistemi cellulari interi e come singoli canali in patch di membrana escisse. Molte mutazioni-fibrosi cistica provocando hanno dimostrato di alterare questa attività. Mentre un piccolo numero di protocolli di purificazione sono stati pubblicati, un metodo ricostituzione veloce che mantiene l'attività del canale e un metodo adatto per studiare l'attività del canale popolazione in un sistema purificato sono stati carenti. Qui metodi rapidi sono descritti per la purificazione e la ricostituzione funzionale della proteina CFTR full-length in proteoliposomi di definita composizione lipidica che mantiene l'attività come canale alogenuro regolamentato. Questo metodo ricostituzione con un nuovo saggio basato flux-dell'attività del canale è un sistema adatto perlo studio delle proprietà del canale popolazione di selvatici tipo CFTR e causano malattie mutanti F508del- e G551D-CFTR. In particolare, il metodo ha utility a studiare gli effetti diretti di fosforilazione, nucleotidi e piccole molecole quali potenziatori e gli inibitori sull'attività del canale CFTR. I metodi sono anche suscettibili di studio di altri canali di membrana / trasportatori per substrati anionici.

Introduzione

Trasporto di cloruro attraverso le membrane apicale delle cellule epiteliali in tali tessuti come le ghiandole polmone, intestino, pancreas e sudore è mediata principalmente dalla fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR), un ATP e membro fosforilazione regolamentato della ABC (ATP Binding Cassette) C sottofamiglia di proteine ​​di membrana (rivisto in ^1). Come altri membri della sottofamiglia ABCC, CFTR è un grande, multi-spanning proteina integrale di membrana che lega l'ATP a due siti di legame di nucleotidi formate all'interfaccia dei suoi domini nucleotide binding (NBDS), dove possiede ATPasi modesta in un unico site. Tuttavia, a differenza di altri membri sottofamiglia ABCC, CFTR è evoluto come un canale unico regolamentato Cl, piuttosto che come un soluto transporter attiva.

Le mutazioni in CFTR causa la fibrosi cistica, una malattia che colpisce diversi organi tra cui i polmoni, tratto gastrointestinale, del pancreas e del tratto riproduttivo, portando a Morbidity e mortalità nei giovani adulti. Malattia polmonare solitamente rappresenta mortalità precoce nella fibrosi cistica e nella maggior parte dei casi è causata dalla perdita di funzione di CFTR sulla superficie dell'epitelio delle vie aeree di conduzione. La mancanza di CFTR canale attività cloruro provoca una riduzione sia Cl ^- e il movimento dell'acqua attraverso l'epitelio superficie per modificare lo strato di liquido sulla superficie apicale dell'epitelio respiratorio ciliato. Ciò si traduce in un liquido viscoso di superficie delle vie aeree che riducono la capacità di cellule epiteliali respiratorie ciliate a patogeni efficacemente sgombrare delle vie aeree. Di conseguenza, la maggior parte dei pazienti con fibrosi cistica soffrono di attacchi ricorrenti di infezione polmonare e danni ai polmoni a causa di infiammazione.

Come previsto, studi del meccanismo di azione della normale proteina CFTR è concentrata principalmente su studi elettrofisiologici modalità della sua attività gating canale. Studi di canale singolo hanno dimostrato direttamente che funziona CFTR come PKA-dipendente Cl^- Canale che possiede un ATP cancello regolamentato ^2. Dettagliati studi elettrofisiologici forniscono una grande quantità di informazioni sui canali CFTR singoli ^1,3, ma ci possono essere preoccupazioni sul fatto che le caratteristiche di un particolare singolo canale che è stato studiato è riflettente di tutta la popolazione di canali CFTR e quindi il singolo canale risultati devono sempre essere considerati insieme con i metodi per studiare la popolazione macroscopico. Analisi diretta del canale attività popolazione di CFTR purificato ha il potenziale per fornire una conoscenza del difetto molecolare associata a mutazioni che causano malattie e per guidare la scoperta di modulatori chimici quali riparazione proteine ​​CFTR mutante. Ad oggi, ci sono in eccesso di 1.900 differenti mutazioni nel CFTR pensato per causare la fibrosi cistica ^4. La mutazione importante, F508del-CFTR, che si trova in almeno un allele in circa il 90% dei pazienti in Nord America e in Europa conduce alle proteine ​​misfolding unritenzione nd nel reticolo endoplasmatico ^5. F508del-CFTR ha anche altre conseguenze, tra cui l'attività del canale difettoso ^6-9. La risultante assenza di CFTR dalla superficie cellulare è associata con la malattia grave. G551D-CFTR, una mutazione meno comune, è pensato per essere adeguatamente ancora piegato è disfunzionale come canale del cloro sulla superficie cellulare ^6. Lo sviluppo di piccole molecole correttori e potenziatori ha rispettivamente lo scopo di correggere piegatura e / o traffico di mutanti, come F508del-CFTR alla superficie cellulare, e di potenziamento o aumentando l'attività del canale di mutazioni come G551D quando presenti sulla superficie cellulare, . Mentre i correttori VX-809 e VX-661 (non sono ancora approvati per l'uso nei pazienti, il potenziatore Kalydeco (ivacaftor, VX-770) viene utilizzata a 150 mg ogni 12 h nei pazienti con FC> 6 anni con almeno un G551D mutazione -CFTR, e più recentemente per i pazienti con uno dei G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pe G1349D. Kalydeco è sicuro e si traduce in un miglioramento delle misure cliniche della malattia CF ^10, ma il meccanismo di azione di questo piccola molecola è stato poco compreso al momento della approvazione della FDA per l'uso in pazienti.

Una manciata di metodi di purificazione CFTR sono state descritte in precedenza ^2,11-18, molti dei quali richiedono un considerevole periodo di tempo per completare. In una recente pubblicazione ^19, un metodo di purificazione e ricostituzione rapida unico è stato descritto per CFTR sovraespresso in S f sistema di espressione 9 cellule, e questa proteina purificata in sistemi lipidici definiti stato usato per sviluppare un alogenuro CFTR determinazione dell'attività canale per una popolazione di CFTR molecole. Il test ricapitola i noti effetti di fosforilazione, nucleotidi e gli inibitori sulla funzione CFTR. Il sistema è stato utilizzato per interrogare gli effetti del potenziatore VX-770 / Kalydeco su WT- (wild-type), e F508del- G551D-CFTR ed è stato mostrato per la primatempo che il farmaco interagisce direttamente con la proteina CFTR potenziano l'attività del canale in maniera indipendente ATP, dimostrando l'utilità e l'applicabilità di questi metodi per lo studio dell'interazione di CFTR e mutanti con nucleotidi e piccole molecole da una prospettiva popolazione rispondere alle domande clinicamente rilevanti circa la proteina. I metodi sono stati utilizzati per studiare altre molecole potenziatore e loro derivati ^​​20, nonché gli effetti di una piccola molecola di correttore sull'attività della proteina ^21.

Saggi efflusso sono stati utilizzati in molti studi precedentemente per studiare l'attività di mutanti CFTR e gli effetti dei composti CFTR-modulatori sulla sua attività, compresi saggi cellulari totali utilizzando elettrodi, traccianti radioattivi e fluorofori ^22,23, vescicole di membrana con elettrodi iono selettivi ²⁴ , e purificato CFTR ricostituito con traccianti radioattivi ^25. Tuttavia the l'uso di elettrodi iono selettivi per studiare purificato CFTR ricostituito è stato segnalato di recente ^19. Un adattamento del metodo attuale è stata utilizzata per la ricostituzione e la caratterizzazione funzionale di due proteine ​​di membrana in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno CF comune. Ricostituzione di purificato Alge proteina della membrana esterna insieme con misure di efflusso ioduro sono stati usati per sostenere un modello per la secrezione alginato anionici attraverso questo trasportatore ^26. Ricostituzione e misurazioni efflusso ioduro stati applicati alla proteina Wzx purificata, che ha permesso un modello da proporre che suggerisce un meccanismo antiport -dipendente H ⁺ per lipidi-linked oligosaccaride traslocazione attraverso la membrana interna batterica da questa proteina ^27. In entrambi i casi ioduro è stato usato come un surrogato per il substrato anionico, anche se a velocità inferiore a quanto ci si potrebbe aspettare per un substrato nativo. Il metodo può essere adatto per l'adattamento ad altre proteine ​​con cdi trasporto o di conduzione percorsi ationic per substrati anionici.

Qui una procedura di purificazione rapida è descritto per la proteina CFTR e la sua ricostituzione in proteoliposomi di lipidi definito. La procedura di ricostituzione rapida può essere facilmente adattato per l'uso con CFTR purificato con altri metodi, a condizione che il tipo di detersivo utilizzato nella purificazione è facile da eliminare con i metodi qui o può essere sostituito con un detergente adatto prima della procedura di ricostituzione. Il metodo efflusso ioduro di misurazione dell'attività di proteina canale CFTR purificata e ricostituito è descritta in dettaglio e alcuni risultati tipici che possono essere ottenuti da questo metodo sono rappresentati.

Protocollo

1. Purificazione di CFTR

NOTA: Si prega di vedere la tabella di materiali e attrezzature per un elenco delle attrezzature e dei materiali utilizzati in questo protocollo. Esiste un protocollo dettagliato per la sovraespressione di umano Wt-CFTR e mutanti in S f sistema di espressione 9-baculovirus ^17,28. Iperespressione di CFTR e preparare pellets di S f 9 celle secondo questo protocollo.

1. Preparazione membrana Crude
   1. Ottenere un fresco o scongelare congelato S f 9 pellet cellulare da una cultura da 500 ml di cellule over-esprimono wildtype-, proteine ​​F508del- o G551D-CFTR con un C-terminale suo ₁₀ -tag, coltivato con metodi standard di coltura cellulare, come descritto in precedenza ^17,28. Pellet cellulari saranno avere un volume di circa 5 ml e un peso umido di circa 5 g.
   2. Risospendere S f 9 cellule in 20 ml di tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4 con inibitori delle proteasi cocktail (1 compressa per 50 ml) a 4 ° C, garantendo lacampione appare visivamente omogeneo e senza grumi di cellule rimangono.
   3. Cellule Lisare con un distruttore cellulare ad alta pressione (Tabella dei Materiali e attrezzature), raggiungendo un minimo di 10.000 psi (preferibilmente 15.000-20.000 psi) per 2 minuti per il passaggio. Mantenere il campione a 4 ° C durante la lisi.
      1. Raccogliere il campione in un tubo sul ghiaccio dopo il periodo di lisi quindi ricaricare immediatamente il campione nel distruttore cellulare. Ripetere procedura lisi 3 volte. Esaminare al microscopio per garantire meno del 10% rimasti intatti.
         NOTA: altri metodi per lisare cellule, come perline di vetro, ecc non sono stati rigorosamente esaminati per questo sistema, un utente può comunque trovare un simile metodo alternativo adatto.
   4. Centrifugare materiale lisi cellulare a 4 ° C in una centrifuga ad alta velocità a 2.000 xg per 20 min. Raccogliere il surnatante e smaltire il pellet. Dividere il surnatante tra 20 tubi e centrifugare i campioni per 1 ora a 4 ° C a 125.000 xg in un tavolo ultracentrifuge.
   5. Rimuovere e scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet, e conservare pellet negli stessi tubi a -80 ° C per meno di 2 mesi fino al momento dell'uso, o tenere a ghiaccio e continuare con la purificazione immediatamente.
2. CFTR solubilizzazione
   1. Ottenere 1-4 S F 9 pellets membrana grezza freschi o surgelati e risospendere ciascuna in 1 ml di tampone 1 (2% fos -Colina; vedere la Tabella 1 per ricetta completa) a 4 ° C su ghiaccio, utilizzando un ago G 25 e 1 siringa ml fino a quando la soluzione è omogenea dall'occhio senza grumi visibili membrana cellulare. Se più pellet è essere solubilizzato, continuare a trattare ogni campione per le istruzioni per un singolo pellet sotto in parallelo, mettendo in comune i campioni al punto 1.3.2.
   2. Sciogliere 1 mini tablet inibitore della proteasi in 1 ml di tampone 2 (imidazolo 10 mm; vedi tabella 1), che manca di fos -Colina 14 detergente (inibitori della proteasi sono 10 volte più concentvalutazione della loro diluizione raccomandata a questo punto) e aggiungere 100 microlitri al pellet risospeso membrana grezza (inibitori delle proteasi sono al loro diluizione raccomandata a questo punto). Situato su ghiaccio per 45-60 minuti con miscelazione per inversione 5 volte ogni 5 min.
   3. Centrifugare risospeso pellet membrana greggio in una un'ultracentrifuga tavolo per 25 min a 125.000 xg e 4 ° C. Conservare il surnatante, che contiene CFTR solubilizzato e scartare il pellet.
3. Colonna vincolante, fosforilazione e eluizione
   1. Lavare 400 microlitri di nichel-NTA (acido nitrilotriacetico) slurry agarosio o resina equivalente con 1 ml di tampone 2 (10 mM imidazolo, vedi Tabella 1) che manca di detersivo, per rimuovere il solvente e buffer a 4 ° C. Ripetere il lavaggio altre due volte.
   2. Combinare CFTR solubilizzato, rimanendo inibitore della proteasi (900 microlitri) e resina nichel (da 400 microlitri slurry) per un totale di 10 ml con tampone 2 (10 mM imidazolo, vedi Tabella 1) which manca qualsiasi detergente. I fos -Colina 14 concentrazione è efficace diluito allo 0,2% (w / v) in questa fase. Se ci sono più tubi, riunire tutti i campioni contenenti CFTR solubilizzato, inibitori della proteasi, resina nichel-NTA e 0,2% (w / v) fos -Colina-14, a questo punto. Incubare per 60 minuti a 4 ° C con delicata agitazione.
   3. Passare CFTR-proteasi inibitore-nichel soluzione NTA giù una piccola colonna di screening (tabella 1) o una colonna vuota equivalente.
   4. Lavare il nickel NTA resina, che viene mantenuto nella colonna, con 4 ml per pellet iniziale di Buffer 3 (imidazolo 10 mm + DDM, vedi tabella 1), che manca di fos -Colina 14, ma contiene 1 DDM mm (dodecil detersivo maltoside), a 4 ° C. Aggiunta di detersivo DDM non altera significativamente il pH di questo buffer.
   5. Preparare la soluzione PKA-MgATP aggiungendo 25 microlitri (5 mm, concentrazione finale) di MgATP, 2.500 U di cAMP-dipendente proteina chinasi A, subunità catalitica (PKA) a 475 ml di tampone 3 (10 imidazolo mM + DDM; vedi tabella 1) alla colonna. Fosforilare proteine ​​sigillando l'estremità inferiore della colonna con un tappo o Parafilm, e aggiungendo 500 ml di soluzione di PKA-MgATP per ciascun pellet iniziale utilizzato.
   6. Incubare a temperatura ambiente (20 ° C) per 20 min con miscelazione delicata e risospensione della resina usando una pipetta 1 ml ogni 2 min per assicurare che PKA è venuto a contatto con l'intera superficie del nickel resina NTA.
   7. Togliere il tappo ed eluire la soluzione PKA / MgATP dalla colonna. Lavare la colonna con 2 ml di tampone 3 (10 imidazolo mM + DDM, vedi tabella 1) a 4 ° C.
   8. Moltiplicare il numero di pellet usato nell'esperimento per 4. Lavare la colonna con questo numero di ml di tampone 4 (imidazolo 50 mM + DDM; vedere Tabella 1) a 4 ° C, aggiungendo 4 ml di tampone per colonna, permettendo di fluire attraverso e immediatamente aggiungere il successivo 4 ml un'aliquota alla colonna.
   9. Eluire la proteina passando (imidazolo 600 mM + DDM; vedere Tabella 1) 1 ml di tampone 5 a 4 ° C per pastiglia iniziale utilizzato attraverso la colonna, 1 ml alla volta senza una pausa per consentire colonna asciugare, e raccogliere l'intero eluato contenente CFTR purificato in un unico tubo.
   10. Concentrato campione di proteine ​​per rimuovere imidazolici e basso peso molecolare di degradazione prodotti utilizzando un dispositivo di filtro centrifuga (100.000 peso molecolare di cut-off), come descritto nella tabella di materiali ed attrezzature o altro dispositivo simile, in un totale di 10 ml tampone 6 (75 mm KI + DDM; vedi Tabella 1) o altro buffer di scelta contenente 1 mM DDM (come Buffer 7 per esperimenti di efflusso non-ioduro, 25 mM HEPES + DDM; vedere Tabella 1), per centrifugazione a 2.000 xg e 4 ° C per circa 20 minuti fino a quando il campione si concentra a 200 microlitri. Diluire il campione di 10 ml e ripetere la fase di concentrazione.
       NOTA: Nella nostra esperienza (inedito), imidazolo significativamente INHIbit Il ATPasi attività di CFTR e deve essere rimosso in questa fase per diluizione e concentrazione almeno due volte se viene utilizzato il campione per misurazioni funzionali.
   11. Raccogliere CFTR purificato concentrato. Conservare a 4 ° C in presenza di tampone DDM fino all'uso entro 1-2 giorni o proseguire immediatamente alla fase ricostituzione. Non congelare la proteina purificata, come nella nostra esperienza osserviamo attività ridotta.

2. Ricostituzione di CFTR

1. Preparazione Lipid
   NOTA: CFTR è stata ricostituita con successo in Egg PC, POPC, 2: 1 (w / w) Egg PC: POPC (1: 1 w / w) della miscela, o una miscela di PE: PS: PC: ergosterolo, 5: 2 : 2: 1 (w / w).
   1. Per gli esperimenti di efflusso ioduro, secco 5 mg di Egg PC (200 ml di 25 mg / ml magazzino, vedi Tabella dei Materiali e attrezzature) sotto un getto di gas argon per 20 minuti a temperatura ambiente in un pyrex o altro robusto (non-borosilicato ) tubo di vetro.
   2. Utilizzando assorbanza a 280 nm, un ELISA unssay o altro metodo, stimare la concentrazione del campione proteina CFTR purificata. Per gli esperimenti di efflusso con ioduro di tipo selvatico CFTR, utilizzare una proteina: rapporto lipidi di 1: 300-1: 3000 (w / w) per produrre un segnale sufficiente. Per G551D- e-F508del CFTR, utilizzare una proteina: rapporto lipidi di circa 1: 200-1: 1200 (w / w) per rilevare l'attività efflusso.
   3. Ottimizzare la proteina: rapporto di lipidi per ogni sistema particolare. Calcolare il volume di proteina purificata richiesto. Calcolare il volume di tampone con 1 mM DDM necessaria per produrre un volume finale di 1 ml, cioè, 1 ml - (volume della soluzione proteica richiesto) = volume di tampone.
      1. Aggiungere il volume calcolato del sistema tampone desiderato con 1 mM DDM al lipide essiccato (ma non aggiungere la proteina CFTR in questo momento) e coprire il tubo di vetro con Parafilm. Per gli esperimenti di efflusso ioduro, lipidi nel buffer 6 risospendere (75 mm KI + DDM, vedi tabella 1). Per altri esperimenti risospendere in Buffer 8 (25 HEPES mM + DDM, vediTabella 1) o un altro buffer interno desiderato contenente 1 mM DDM.
      2. Vortex per 2 minuti a temperatura ambiente per aiutare in sospensione del lipide nel buffer DDM. In alternativa, riscaldare il campione a 37 ° C per 1-2 minuti prima vortex.
   4. Sospendere il lipide ripetutamente a temperatura ambiente con una siringa da 1 ml e 25 G ago finché non film lipidico è visibile sui lati del tubo. Evitare di iniettare aria nella soluzione che produrrebbe bollicine e aiutare nella ossidazione di ioduro e lipidi.
   5. Sonicare i lipidi sospeso nel Parafilm coperto tubo per una raffica di 20 secondi in un bagno di sonicazione ghiaccio contenente, e poi trasferire immediatamente in ghiaccio per 1 min. Ripetere 3 volte.
      NOTA: sonicazione intenso trasforma soluzioni ioduro gialle a causa dell'ossidazione. Quindi evitare un'eccessiva ultrasuoni. Monitorare il campione per cambiamenti di colore. Se si nota una variazione di colore, scartare il campione e preparare nuovo. Il cambiamento di colore dovuto all'ossidazione di alcunilo ioduro comporterebbe l'ossidazione dei lipidi alle stesse condizioni. Spostare l'aria dal tubo con gas argon prima sonicating soluzione aiuta a prevenire l'ossidazione dei lipidi e ioduro. Sonicazione intenso può rompere di scarsa qualità o tubi di vetro graffiati con conseguente perdita del campione.
   6. Aggiungere il volume di CFTR purificato calcolata al punto 2.1.3 al campione lipidi sonicato per un ottenere un volume finale di 1 ml. Mescolare la proteina con la soluzione lipidica e detersivo risospensione 10 volte con una siringa 25 ago G e 1 ml.
   7. Impostare lipidi e proteine ​​del campione in ghiaccio per 30 min con vorticoso del tubo per mescolare 5 volte ogni 5 min.
2. Detergente-binding preparazione colonna
   1. Ottenere uno spot Spin Column detergente vincolante uso singola (vedi Tabella dei Materiali e attrezzature), con una capacità di volume 1 ml e rompere la linguetta in basso per avviare la colonna di fluire.
   2. Centrifugare la colonna per 2 min a 2000 xg per rimuovere il deposito bUffer, e scartare questo buffer.
   3. Aggiungere 5 ml di tampone 7 (KI 75 mm, vedi tabella 1) alla colonna e centrifugare a 200 xg per 4 minuti per eluire il tampone di lavaggio. Ripetere questa operazione altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi per eliminare tutte le tracce del tampone di conservazione. Gettare tutto flow-through.
      NOTA: E 'fondamentale che il buffer utilizzato per lavare la colonna NON contiene DDM o altro detergente. La colonna ha una capacità di legame finita per il detersivo e se si utilizza un tampone contenente detersivo, colonna sarà inefficace a rimuovere il detergente dal campione proteina-lipide detergente.
   4. Aliquotare attentamente tutte 1 ml del campione lipidi detergente-proteina sulla parte superiore della resina colonna e incubare campione nella parte superiore della colonna per 2 minuti a temperatura ambiente.
   5. Centrifugare il campione a temperatura ambiente per 4 min a 2.000 xg e raccogliere il campione proteoliposome nuvoloso in una provetta per microcentrifuga pulito da 1,5 o 2 ml o un tubo di vetro e posizionare il samPLe sul ghiaccio.
   6. Raccogliere rimanenti proteoliposomi nella colonna aggiungendo 200 microlitri di tampone 7 (KI 75 mM, Tabella 1) o altro buffer (senza detergente) alla sommità della colonna e ripetere la fase di centrifugazione per 2 min.
   7. Aggiungere il secondo eluato al campione proteoliposome se sembra nuvoloso.
   8. Conservare il campione a 4 ° C durante la notte o usare immediatamente per misurazioni efflusso ioduro.

3. ioduro efflusso Misure per purificata, CFTR ricostituita

1. Generazione di un gradiente di ioduro attraverso la membrana proteoliposomal
   1. Perline Pre-swell Sephadex G50 a Buffer 9 (75 mm K-Glu, glutammato di potassio, vedi tabella 1), (circa 5 g di perle e asciutto in 50 ml di buffer) o cuscinetto esterno desiderato a temperatura ambiente per almeno 2 ore o al 4 ° C durante la notte.
   2. Preparare 4 colonne Sephadex G50 saturi a tampone 9 (75 mm K-Glu, vedi Tabella 1) o altrobuffer in colonnine di screening caricando resina ad almeno ¾ pieno nella colonna.
   3. Centrifugare per 4 min a 2.000 xg per rimuovere il tampone in eccesso dalla resina. Ci dovrebbe essere di circa 2,25 ml di resina idrata imballato nella colonna al termine della fase di centrifugazione.
      NOTA: resina deve essere idratata con leggerezza, ma non immerso in un liquido e un successivo breve giro non dovrebbe eluire volumi significativi di buffer. E 'fondamentale per il successo eluizione del campione proteoliposome che la resina colonna è né troppo bagnata né troppo secca e l'utente può avere bisogno di sperimentare con le colonne al fine di familiarizzare con le condizioni di scambio di buffer di maggior successo.
   4. Aggiungere con cautela 125-150 microlitri di proteoliposome campione all'inizio di ogni colonna e centrifugare per 4 min a 2000 x g.
   5. Pool proteoliposome eluati insieme per l'uso immediato in efflusso ioduro o altri esperimenti.
      NOTA: Il volume eluito dalla ciascuna colonna dovrebbe essere approssimativamente150 ml e il campione dovrebbe essere un po 'nuvoloso, ma meno torbida del campione originale. Volumi più grandi o eluati chiare suggeriscono che le colonne non sono state sufficientemente essiccato, o sono stati essiccati troppo rispettivamente, e non si tradurrà in un esperimento ioduro di efflusso successo.
2. Iodide test efflusso
   1. Lavare un micro elettrodo selettivo ioduro (Tabella dei Materiali e attrezzature) ampiamente con acqua deionizzata, e poi incubare per 20 minuti prima dell'esperimento in Buffer 10 (15 micron KI, vedi tabella 1). Lavare l'elettrodo di nuovo a lungo con acqua deionizzata.
   2. Aggiungere 150 ml di farmaco (20 mM concentrazione tipica per produrre una concentrazione finale di 10 mM nel saggio) in tampone 9 (75 mM K-Glu, vedi Tabella 1) o il veicolo in tampone 9 ad un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con una piccola ancoretta pulci.
      1. Assicurarsi che non vi siano bolle presenti. Utilizzare un puntale per rimuovere randagiobolle. Se si utilizza una soluzione di droga, affinché la concentrazione finale di DMSO nel pozzo è inferiore all'1% (v / v) (tipicamente 0,1-0,2% (v / v)).
   3. Aggiungere 150 ml di proteina CFTR ricostituito che è stato prodotto nella sezione 3.1 in Buffer 9 (75 mM K-Glu, vedi Tabella 1) al pozzo con farmaco o tampone, per produrre un volume totale di 300 microlitri nel pozzetto della piastra.
   4. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un piatto mescolare e mescolare a 130 rpm (o ad una velocità moderata di circa ¼ della velocità massima).
   5. Inserire la punta dell'elettrodo selettiva ioduro attenzione nel pozzetto con il campione in modo che la punta non tocchi il fondo del pozzo o di essere colpito dalla ancoretta. Assicurarsi che l'elettrodo di riferimento, se separati, è anche in contatto con la soluzione nel pozzo.
   6. Tracciati record utilizzando un programma per computer fatto in casa o commerciale che si interfaccia con l'elettrodo (vedi tabella di materiali e attrezzature per i dettagli).Utilizzare una frequenza di campionamento di 2 Hz, con filtraggio del segnale mediante un filtro passa basso.
   7. Lasciare che il campione si stabilizzi per 5 minuti per produrre una linea di base piatta piana e stabile, o in prossimità durante la registrazione.
   8. Aggiungere 3 ml (magazzino mm 100 preparata in dH ₂ O e portata a pH 7 con KOH, 1 mM concentrazione finale) MgATP al campione per attivare la proteina. Lasciare ~ 5 minuti per raggiungere una nuova linea di base stabile. Regolare sempre il pH della MgATP mM magazzino 100 in folle prima dell'uso per evitare variazioni del pH del tampone esterna.
   9. Aggiungere 3 ml di valinomicina magazzino (2 micron; 20 nM concentrazione finale) per il campione per smistare cambiamenti nella differenza di potenziale generata da ioduro selettivo conduttanza attraverso CFTR. Registrare la pendenza diminuzione (diminuzione mV) a causa di attività di ioduro efflusso CFTR-mediata per almeno 5 minuti.
   10. Per garantire che la cattura di ioduro nel lume proteoliposome era sufficiente, aggiungere 3 ml di 10% (v / v) Triton X-100 al campione. RILIEVOt e rilascio immediato ioduro indica che ioduro sufficiente è stata intrappolata nelle vescicole tale che cattura non è stato il fattore limitante per le variazioni di pendenza determinate 3.2.9, ma piuttosto l'attività CFTR-mediata.
   11. Lavare la barra elettrodo e mescolare a fondo con acqua deionizzata dopo il trattamento dei campioni con farmaco o con Triton X-100 per garantire tutte le tracce di questi reagenti sono stati rimossi per evitare la contaminazione del campione successivo.
   12. Preparare una serie di concentrazioni diluite KI nel micromolare di gamma nanomolare a tampone 9 (tampone K-Glu, vedi Tabella 1). Registrare la risposta mV dell'elettrodo per ciascuna concentrazione da 0 alla massima concentrazione preparata. Costruire una curva standard in cui la risposta della sonda (mV) viene tracciato rispetto log della concentrazione di ioduro molare. Utilizzare la curva standard per convertire la risposta mV della sonda durante l'esperimento efflusso alla concentrazione di ioduro rilasciato.
       NOTA: Preparare una cur calibrazioneve su base settimanale finché un utente è sicuro della rapidità della risposta dei cambiamenti sonda. Ci sarà una deriva nella risposta e la sensibilità della sonda nel tempo. Con l'invecchiamento della sonda, la risposta si degrada. Questo può essere parzialmente abrogata cambiando le soluzioni interne periodicamente e vasta lavaggio della punta della sonda in acqua dopo l'uso, che limiti probabili aderenza molecole alla superficie della sonda.
   13. Determinare la pendenza media della linea della concentrazione rispetto plot tempo per ciascun campione proteoliposome per gli ultimi 30 secondi prima dell'aggiunta MgATP, e dopo l'aggiunta di valinomicina ma prima dell'aggiunta di Triton X-100. Sottrarre la pendenza della linea di base dalla valinomicina per determinare l'attività di ioduro efflusso CFTR-mediata per quel campione.

Risultati

Descritto in questa pubblicazione scritta sono metodi per purificare, ricostituire e misurare l'attività dei canali regolamentata della proteina CFTR. Figura 1a mostra il flusso di lavoro per la purificazione, la ricostituzione e le procedure di efflusso ioduro. Metodi per la ricostituzione e l'attività dei canali misure di flusso ioduro sono anche indicati in dettaglio nel video associato.

Purificazione e ricostituzione di CFTR in proteoliposomi

Discussione

Ci sono stati un numero limitato di protocolli di purificazione per tutta lunghezza, isolamento CFTR funzionale, da una varietà di sistemi iperespressione cellulari. Il metodo qui descritto è vantaggioso in quanto consente una rapida purificazione di Wt-CFTR o alto arricchimento di F508del- e G551D-CFTR in quantità moderate, che è altamente funzionale in saggi, tra cui ATPasi e misure dirette di funzione del canale, tra cui le misure a canale singolo a doppio strato planare sistemi e le misure dimostrato di funzione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
fos-choline 14 detergent	Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)	F312	Affymetrix: Anatrace Products; CAS# :77733-28-9
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche (www.roche-applied-science.com)	04 693 132 001	EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack	Roche (www.roche-applied-science.com)	05 892 791 001
Ni-NTA Agarose	Qaigen GmbH	1018240
Fisherbrand Screening columns	Fisher Healthcare	11-387-50
Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K	Millipore (www.millipore.com)	UFC910008
cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit	New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)		Peirce PKA is also suitable
PC, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840051C
POPC	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	850457C
PS, Porcine Brain	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	840032C	(CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w))
PE, Chicken Egg	Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)	841118C
Ergosterol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	45480
Pierce Detergent removal spin column	Thermo Scientific	87779	1 ml capacity columns
valinomycin	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	V-0627
VX-770 (ivacaftor)	Selleck Chemicals	S1144
iodide selective microelectrode	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)	LIS-146ICM
Clampex 8.1 software	Axon Instruments (www.axon.com)		we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode
Alternate Software: ArrowLabb System	Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)	LIS-146LICM-XS	Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.  This software should serve a similar function to our setup
small stir bars	Big Science Inc (www.stirbars.com)	SBM-0502-CMB	choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate
Sephadex G50, fine	GE Health Care (www.gelifesciences.com)	17-0042-01
Sonicator	Laboratory Supplies Co, Inc.	G112SP1G	Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable