신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 ​​모세포종의 소설 모델을 생성합니다

요약

Here we describe an efficient and versatile protocol to induce, monitor and analyze novel glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate and generate tumors with histo-pathological characteristics of human GBM.

초록

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary brain tumor in adults with dismal prognosis. New potential therapies are rapidly emerging from the bench and require systematic testing in experimental models which closely reproduce the salient features of the human disease. Herein we describe in detail a method to induce new models of GBM with transposon-mediated integration of plasmid DNA into cells of the subventricular zone of neonatal mice. We present a simple way to clone new transposons amenable for genomic integration using the Sleeping Beauty transposon system and illustrate how to monitor plasmid uptake and disease progression using bioluminescence, histology and immuno-histochemistry. We also describe a method to create new primary GBM cell lines. Ideally, this report will allow further dissemination of the Sleeping Beauty transposon system among brain tumor researchers, leading to an in depth understanding of GBM pathogenesis and progression and to the timely design and testing of effective therapies for patients.

서문

수술, 방사선 요법, 화학 요법으로 치료 ^한 경우 다형성 교 모세포종 (GBM)는 15~21개월의 평균 생존 기간으로, 성인에서 가장 흔한 (60 %) 차 뇌종양이다. GBM에 대한 소설 치료는 필수적이다. 실험 요법 적절히 인간 질병의 두드러진 특징을 재현 동물 모델에서 시험을 요구한다. 설치류 교종 ^세포주를 사용하여 ^화학이 알킬화제와 돌연변이 유발, 또는 배아 체세포 유전자 변형, 또는 이식을 포함 GBM의 전략을 유도한다. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 뇌 내로 또는 피하로 동일한 유전자형의 동물 세포를 이용하여 동계 어느 동소, 신경 교종 세포주 주입을 채용; 또는 이종 세포는 면역에 이식 가장 일반적으로 인간 GBM 세포주, 마우스 ³ 손상. 이종 이식은 두개 내 종양의 연구에 많은 장점을 제공합니다 재현성의 편의를 위해, standardized 성장률, 죽음과 종양 현지화의 시간. 의사 pallisading 괴사, 핵 atypias, 미만성 침윤, 미세 혈관의 증식 : 착상하고 정확하게 조직 학적을 재현하는 능력의 한계에 사용되는 인공, 침습 수술 방법으로 인간의 GBM (WHO 4 등급)의 특성을 특징으로 인해 그러나 이러한 모델은 한계를 가지고 및 glomeruloid 혈관의 형성은 ^4-7 나 비정상. 종양 DNA와, 중 바이러스 벡터 ^8-12, 또는 트랜스포존 매개 통합 ^13과 체세포의 게놈을 변경하여 GBM의 유도는 더 밀접하게 인간의 질병의 원인을 재현하고 인간의 GBM의 histo-병리학 적 특징을 되풀이.

역사적으로, 중추 신경계의 종양 분류가 관찰되었다 기원의 인식 셀을 기반으로 한, 생존 ^(14)에 대한 예측 요인이 될 것입니다. GBMs 기본 및 보조로 분류된다. 신흥 증거 TOD님이 차 아교 모세포종 ^(15)의 매우 이질적인 성격을 가리키는. 보조 GBM (15 %), 낮은 등급의 성상 세포종 (WHO 등급 I)과 anaplasic 성상 세포종의 악성 변환 결과 (WHO 등급 II), 질병의 초기 발병, 더 나은 예후 및 유전자 발현의 "proneural"패턴과 연관된 차 GBM (85 ​​%) 반면, 발성, 불량한 예후와 아교 (클래식), 신경 또는 중간 엽 발현 패턴을 보여줍니다. 유전자 발현의 이러한 패턴의 유래 종양의 실제 셀과 상관 여부 여전히 활발히 연구되고있다. 데이터를 축적하면 GBMs와 연관된 유전 적 돌연변이의 조합이 생존 예측 것을 보여준다. 예를 들어, 염색체 1P / 19q, IDH1 돌연변이, PDGFRα의 증폭의 heterozygocity의 손실 (LOH)는 EGFR 과발현, 노치와 소닉 고슴도치 경로 활성화 NF-반면, 보조 GBMs, proneural 표현 패턴과 더 나은 예후와 연관된1 PTEN 손실과 p53의 변이는 신경, 클래식, 또는 중간 엽 차 GBM과 나쁜 예후 ^{16, 17과} 관련되어있다. 대규모 시퀀싱 프로젝트의 출현 및 테스트에 사용할 수 많은 환자 검체의 축적은 GBM의 발병과 진행 및 치료 특별히 맞출 수있는 개인화 된 의학의 가능성에 연루 유전자 돌연변이 및 경로에 대한 새로운 풍부한 정보를 제공합니다 환자의 유전 적 비정상. 궁극적으로, 이러한 체계적인 방법 및 돌연변이 경로의 예측값을 평가하고, 각각의 경우에 가능한 치료법을 테스트 소정 유전자 변형 동물과 GBM의 모델을 필요로한다. 게놈 DNA의 트랜스포존 매개 통합은 실현 가능한 접근 방식을 제공합니다.

잠자는 숲속의 미녀의 트랜스포존 시스템, 트랜스포존의에 T / 선원 클래스의 멤버는, 다단계 proce을에서 (건설) "깨어"했다휴면보다 10 만 년 전 ^{(18, 19)가} 된 salmonoid 트랜스 유전자에서 특정 사이트 돌연변이의 SS. 본질적으로, 특정 시퀀스 (반전 반복 / 직접 반복 : IR / DR)에 의해 측면 DNA 트랜스포존은 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스의 활동에 의해 "잘라 내기 및 붙여 넣기"방식으로 게놈에 통합 할 수 있습니다. 트랜스는, IR 사이트의 끝을 인식하는 트랜스포존을 소비세 및 기지 T와 A, 전위 (그림 1a) 동안 트랜스포존의 각 끝 부분에 중복 기지 사이에 다른 DNA 사이트에 무작위로를 통합합니다. 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스은 세 가지 영역, 트랜스포존 결합 도메인, 핵 이행 순서와 촉매 도메인으로 구성되어 있습니다. 트랜스 포 분자 함께 트랜스포존의 양단을 가져다 전치 있도록, 트랜스의 너무 많은 분자가 존재하는 경우, 그들은 이량하고 억제하는 데 필요한 tetramerize전위 반응 ^(20). 효율적인 전위 반응은 트랜스포존에 트랜스의 최적 비율을 필요로한다. 트랜스를 코딩하는 DNA는 (시스)에서 트랜스포존과 같은 플라스미드 또는 (트랜스)에서 상이한 플라스미드 상에 전달 될 수있다. 트랜스와 트랜스포존 간의 최적 비를 확보하기 위해, 충분한 활성을 갖는 프로모터에 대해 (( "CIS"모델) 트랜스의 발현 또는 최적화 될 수 주사액에서 플라스미드의 비율에 대해 선택 될 수있다 "트랜스"모델). 잠자는 숲속의 미녀 transposon의 시스템은 기능 유전체학,에서 삽입 돌연변이 유발, transgenesis 및 체세포 유전자 치료 ⁽²¹⁾ 성공적으로 사용할 수 있습니다. 합성 구조는 휴면 salmonoid 변형에서 기능성 분자를 재 설계이기 때문에, 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스는 사람이나 다른 포유 동물 ^(20)의 다른 트랜스포존에 결합하지 않습니다. 그 발견 이후, 분자 공학 enhanc있다ED IR 시퀀스 및 TATA 디 ​​뉴클레오티드는, 트랜스포존 측부 PT2 트랜스포존 결과의 변화를 통해 부가 SB 트랜스포존 시스템의 전치 효능. 이러한 트랜스포존 IR 사이트 SB의 결합을 최적화 절개 효능을 증가했다. SB의 트랜스도 상당한 개선을 받았다; 본원에 제시된 실험에 사용은 트랜스 SB100X, 포유 동물 세포에서 ²² 대규모 유전자 스크린 뒤에 DNA 셔플 전략에 의해 생성 하이퍼 트랜스이다.

이보고에서는 신생 생쥐 ^(23)의 서브 영역의 심실 세포로의 플라스미드 DNA의 비 바이러스, 트랜스포존 매개 통합 마우스에서 극한 GBM을 유도하는, 급속 다용도 재현 방법을 제시한다. 우리는 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스를 사용하여 게놈 통합을위한 의무가 새로운 유전자 트랜스포존을 만들고 플라스미드 흡수를 모니터링하는 방법을 설명하는 간단한 방법을 제시하고생물 발광을 사용하여 질병의 진행. 우리는 또한이 모델 재현 GBM의 조직 학적 및 면역 조직 화학적 기능을 특징. 또, 이들 원발성 종양 GBM 세포주를 생성하는 빠른 방법을 제시한다. 종양 동물에게 원래 세포로부터 유도되는 슬리핑 뷰티 모델은 유도 및 종양 진행에 GBM 후보 유전자의 기능적 역할의 평가를 허용한다. 이 시스템은 또한 잘 로컬 미세 환경을 변경할 수 침습적 염증 수술의 필요없이, 면역 능력이 생쥐의 면역 요법을 포함한 새로운 GBM 치료의 테스트에 적합합니다.

프로토콜

참고 : 모든 동물 프로토콜이 동물의 사용 및 관리에 대한 미시간위원회의 대학 (UCUCA)에 의해 승인되었습니다.

새로운 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존에 관심의 순서 1. 복제

참고 : 유전자 또는 잠자는 숲속의 미녀의 트랜스 시스템을 사용하여 (shRNA를 등) 억제 요소를 삽입하려면, PKT 또는 PT2 플라스미드의 중추로 관심의 순서를 복제. 복제를 직접 규제 요소, 관심과 마커의 유전자가 반전 반복 (IR / DR)의 어귀를 유지하도록. 아래에 자세히 설명되어 있습니다 PKT 백본에 PDGFβ 복제의 예 (참조 그림 1b).

1. 반응 부피 50 μL를 XbaI에서 /의 XhoI 제한 효소의 단위를 37 ~ 10 ° C에서 4 시간 플라스미드 벡터 PKT-IRES-Katushka 5 μg의 다이제스트.
2. 5-10 부와 37 ° C에서 4 시간을 pGEM-T- mPDGFβ 플라스미드 5㎍을 mPDGFβ의 cDNA를 다이제스트를 NcoI / SacI로 제한 효소들.
3. 100 % 에탄올 2.5 권, 3 M 아세트산 나트륨, pH가 5.8의 1/10 부피를 첨가하여 전체 DNA를 석출시킨 -20 ° C에서 밤새 배양한다.
4. 15 분 동안 13,800 XG에서 샘플을 원심 분리기.
5. 1 분 동안 13,800 XG에 70 % 에탄올, 원심 분리기 500 μL와 DNA 펠렛을 씻으 번 반복 멸균 DNase를 무료로 물 19 μL에 다시 일시 중지합니다.
6. (mPDGFβ)를 모두 벡터 (PKT-IRES-Katushka)의 끝을 무디게하고 삽입 빠른 블 런팅 키트 제조업체의 지침을 따르십시오.
7. 무딘 벡터를 넣고 1.2 % 에티 디움 브로마이드 스테인드 아가 로스 겔에 넣고 40 분 동안 80 V에서 실행합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 겔 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하여, 밴드를 시각화 깨끗한 면도기 블레이드 겔로 절제.
8. 1 몰비 (삽입 : 벡터) 사에서 튜브에 추가하여 단​​계 1.7 정제 삽입 및 벡터 DNA를 결찰. 이 튜브, 페이지 속으로ipette T4 리가 1 μL와 (ATP를 포함) T4 리가 버퍼의 2 μL, 멸균 물을 20 μL로 볼륨을 조절합니다. 16 ° C에서 18 시간 동안 연결 반응을 품어.
9. 결찰 유능한 화학 제품 DH5α 세포를 형질 전환 박테리아.
   1. 얼음에 관할 세포를 해동.
   2. , 적격 세포를 50 μL로 연결 반응의 전체 볼륨을 추가 부드럽게 흔들 관을 30 분 동안 얼음에서 인큐베이션 믹스. 42 ° C에서 45 초 동안 박테리아를 열 - 충격과 얼음에 즉시 반환; 추가 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
   3. 문화 루리아 국물의 950 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양한다. 원심 분리기 박테리아 2,400 XG에 3 분 동안 (LB)의 200 μL의 펠렛을 다시 중단
   4. LB 아가 로스 및 해당 항생제로 코팅 페트리 접시에 형질 전환 된 박테리아를 확산. 37 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
   5. 마지막으로, 5 ~ 10 bacte를 수집리얼 식민지 항생제와 LB 미디어 5 ㎖에서 밤새 37 ° C에서 문화.
   6. 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 DNA 미니 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제한다. 진단 제한 벡터 내로 삽입 체의 적절한 혼합을 확인하고 인서트의 오른쪽 방향을 보장하기 위해 DNA 시퀀싱 양성 클론 제출 다이제스트 수행.
10. 무료 플라스미드 준비 키트를 내 독소, 올바른 식민지를 선택하고 높은 품질을 사용하여 DNA 생산을 확장 할 수 있습니다.
11. 멸균 또는 1 mM 트리스 - 염산의 DNA를 용출시켰다. 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 저장 DNA는 신생아에 주입합니다.

2. 내부 심실 신생아 주사

1. 실험 3 ~ 4 주 전에, 한 남자와 한 여자 마우스 및 플라스틱 색깔 이글루의 마우스와 사육 케이지를 설정합니다. 이는 농축 된 환경을 제공하고 결합 프로세스를 돕는다.
2. 임신이 확인 된 경우, m 삭제새 케이지 에일. 열 여덟 일 짝짓기 후, 배달을 위해 매일 케이지를 모니터링 할 수 있습니다. 출생 후 하루 1 (P1)에 뇌 실내 주사를 수행합니다.
3. 주사액의 제조
   주 : 주사 용액을위한 형질 입자를 만드는 형질 전환 시약 플라스미드 DNA를 혼합함으로써 만들어진다. PT2 / SB100x 뤽 두 트랜스포존 플라스미드 : pT를 / CAGGS-NRASV12 및 Pt / CMV-SV40-LGT의 비율로 아래 슬리핑 뷰티 트랜스 및 루시퍼 라제를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 주입 용액의 제조에 대한 예는 1 : 2 : 2. 모든 플라스미드는 2 ㎍ / μL의 농도를 갖는다. 주사액의 제조에 중요한 세부 사항이 논의에서 제시된다.
   1. / CMV-SV40-LGT, 10 μl를 4 μg의 (2 μL)의 Pt PT2 / SB100x 룩, pT를 / CAGGS-NRASV12 8 μg의 (4 μL), 8 μg의 (4 μL)의 : 추가하여 DNA 솔루션을 준비 1 ㎍ / ml의 농도에서 20 μL의 최종 부피로 10 %의 글루코오스DNA, 5 % 글루코스.
   2. 5 % 글루코스의 최종 농도 생체 제트 PEI 2.8 μL, 멸균 7.2 μL, 10 % 글루코스 10 μl를 첨가하여 PEI 용액을 준비한다.
   3. 상기 DNA 용액에 PEI의 혼합 용액을 첨가하고 보텍스 20 분 동안 실온 (RT)에 앉게. 이 솔루션은 이제 주입을위한 준비가되어 있습니다. RT에서 1 시간 후, 얼음에 솔루션을 유지.
   4. 마이크로에 12.5 ° 경사와 30 게이지 피하 주사 바늘이 장착 된 10 μL 깨끗한 주사기를 장착한다 (그림 2 # 1).
4. 분사 시스템의 적절한 기능을 확인하려면, 자동 주사기를 사용하여 (그림 2 # 1) 주사기에 물 10 μl를 철회하고 완전히 주사기를 비 웁니다
5. 신생아 정위 쿨 스테이지 (도 2 # 3) 2-8 ℃의 온도로 드라이 아이스와 알코올의 슬러리.
6. 젖은 얼음에 새끼를 배치하여 마취를 유도2 분. 마취 절차의 나머지 부분에 대한 냉각 고정대에 계속됩니다. C는 열상 부상을 방지 할 2-8 ° 사이, 영하 프레임의 온도를 유지하면서. 같은 특별한 예방 조치 새끼는 젖은 얼음에 배치하기 전에 거즈에 싸서 할 수 있습니다.
7. DNA / PEI 솔루션으로 주사기를 입력합니다.
8. 거즈 덮여 귀 바 (그림 2b) 사이에 머리를 배치하여 고정대에서 강아지를 고정. 두개골의 등쪽면이 수평이되었는지, 프레임의 표면에 평행 두개골 봉합 명확하게 볼 수 있도록. 70 % 에탄올로 머리를 닦아냅니다.
9. 주사기의 바늘을 내리고 바늘이 람다 (정수리와 뒤통수 뼈의 중간 선 교차) (그림 2B)에 닿을 때까지 고정대의 다이얼을 사용하여 정위 좌표를 조정합니다.
10. 바늘을 올리고 0.8 mm 가로 1.5 m에 정위 좌표를 조정람다 (그림 2b)에 m의 주동이.
11. 끝이 닿을 약간 피부를 딤플 때까지 바늘을 낮 춥니 다. 좌표를 측정한다. 바늘 또 다른 1.5 mm를 낮 춥니 다. 바늘이 피부와 두개골을 관통하고, 뇌실 (그림 2C)를 입력 피질을 통과하게된다.
12. 자동 주사기를 사용 / 분 0.5 μL의 속도로 DNA / PEI 용액 0.75 μL를 주입
13. 이 솔루션은 심실로 분산 할 수 있도록 다른 분을 위해 프레임에 강아지를 유지합니다. 한편, 다음의 주입을위한 준비에 2 분 동안 얼음에, 다른 강아지 마취.
14. 부드럽게 천천히 바늘을 들어 올려 가열 램프 아래에 강아지를 놓습니다. 호흡과 활동을 모니터링합니다. 필요한 경우 처음 호흡이 계속된다 때까지, 사지의 부드러운 자극을 제공합니다.
15. 이 예열, 정기적으로 호흡, 장미 빛 색상에 도달하고 보통 5-7 분 활성화 된 후 어머니에 강아지를 돌려줍니다. 미주리 경우한 강아지가 한 번에 주입보다 재, 모든 주입이 완료 될 때까지 모두 함께 새끼를 유지합니다. 주사 30 분 이상 걸리는 경우, 처음 30 분 및 절차의 끝에서 나머지 후 새끼의 절반을 반환한다.
16. 댐 반응과 그녀의 새끼를 양육 것을 모니터링합니다. 필요한 경우, 케이지에 대리모를 추가합니다.
17. 얼음에 강아지를 놓고 온난화 램프 아래로 배치 사이의 간격이 10 분 있는지 확인하십시오. 생존 과정을 더 빨리. 보통은 마취 및 강아지를 주입하는 데 걸리는 시간은 4 분이다.

종양의 형성과 진행 3. 생물 발광 모니터링

3.1) 주사 후 플라스미드 흡수를 모니터링

1. 주사 후 24 ~ 72 시간은 6 잘 깨끗한 조직 문화 요리, 한 강아지의 어머니의 케이지 장소에서 모든 새끼를 제거 당 잘.
2. 생리 식염수 또는 phosphat에 용해 루시페린의 30 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비합니다전자 버퍼입니다. 사전에이 솔루션을 준비하고 -20 ° C에서 작은 분량 씩 유지.
3. 30 게이지 피하 바늘을 구비 한 1 ㎖를 주사기를 사용하여 강아지의 어깨 블레이드 간의 루시페린 피하 30 μL를 주입. 바늘이 피부를 곤란하게하고 바늘을 삽입하기 전에 약간 들어 올려, 모든 장기를 관통하지 않도록하십시오.
4. 이미지 즉시 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용하는 경우. 자동 노출, 큰 비닝 (binning),와 조리개 F = 1 : IVIS 스펙트럼의 경우, 인수에 대해 다음 설정을 사용합니다.

3.2) 모니터링 종양 형성과 진행

참고 : 동물, 2½-6 주 이내에 생물 발광 및 조직 검사에 의해 검출 거시적 인 종양을 형성 주입 된 종양 플라스미드에 따라 시작됩니다.

1. 26 게이지 바늘이 장착 된 1 ㎖를 주사기를 사용하여 30 ㎎ / ㎖ 용액 100 루시페린 μL를 복강 내 주사.
2. 마취 실에서 동물을 놓습니다. 동시에 다섯 동물까지 주입한다.
3. 다음 동물을 마취하는 산소 / 이소 플루 란 흐름 (1.5 ~ 2.5 %의 이소 플루 란)를 시작 5 분을 기다립니다. 3-4 분 후, 마취 챔버로부터 동물을 제거 생물 발광 챔버 내의 산소 / 이소 플루 란 흐름을 시작한다. 마취와 빛의 장애물 통과를 허용하도록 유리 코 콘 장착 된 각각의 슬롯에 동물을 놓습니다.
4. 일반적으로, 자동 노출 시간, 중앙값 비닝 및 F = (1)의 구경 조리개 2 분 간격으로 6 일련의 이미지를 획득.
5. 헤드 영역 위에, 통상 타원형 묘화 모든 동물의 관심 영역을 설정하고 / s / cm ² / SR 보정 유닛 광자를 이용한 발광 강도를 측정한다.
6. 각 동물에 대한 최대 값을 기록한다. 이어서, 기록은 예 whe에 대해, 각 동물 및 / 또는 동물 용 간 종양의 진행 중에 비교 될 수있다n은 다른 치료가 사용된다.

새로운 GBMs 4. 조직 학적 및 면역 조직 화학적 분석

참고 : 종양이 원하는 실험 시간이 지점에 도달했을 때, 동물이 희생 될 수있다, 뇌, 관류 고정 및 분석 하였다. 생존을 위해 동물이 증상을 보여주는 장애인 이동성, 웅크 자세와 지저분한 모피가되면 임상 단계에 의해 정의 된대로 동물을 인도적으로, 종양 부담의 첫 번째 징후에 희생 될 때 죽어가는 단계는 실험의 끝점을 나타냅니다 분석한다. 사용되는 표준 조직 학적 및 면역 조직 화학적 방법에 대한 간단한 설명은 아래에 제시되어있다.

4.1) 관류 및 고정

1. 케타민 100 ㎎ / kg 자일 라진 및 10 ㎎ / ㎏ 복강 내 주사하여 마우스를 마취.
2. 마우스의 발을 집어 페달 반사를 확인합니다. 이 반사가 폐지 나타내는 깊은 마취, immob복강을 열고 핀 해부 보드에 마우스를 ilize 다이어프램을 해부 마음을 시각화하는 흉강을 엽니 다.
3. 심장의 좌심실에 무딘 20 게이지 캐뉼라를 삽입합니다. 플라스틱 튜브는, 염화칼슘 ₂ 2H ₂ O 산소와 헤파린 타이로드의 솔루션 (0.8 % 염화나트륨, 0.0264 %로 컨테이너에 연동 펌프를 통해 지나가는 정맥을 연결 0.005 %의 NaH ₂ PO _4, 0.1 %의 포도당, 0.1 %의 _NaHCO3, 0.02 %의 KCl). 느리고 일정한 흐름, 동물이 작은 경우 초 이하인 당 약 한 방울을 위해 연동 펌프의 속도를 조절하여 타이로드의 용액의 유동을 시작한다.
4. 혈액과 타이로드의의 드레인을 허용하는 심장의 우심방에 작은 절개를합니다.
5. 그들은 혈액의 결여됨에 따라 (간 및 신장에서 가장 눈에 띄는) 내부 장기의 창백을 관찰하여 관류 효율성을 모니터링합니다.
6. 때심장에서 배출 솔루션 (3-5 분) 분명, 고정 (4 % PFA, 인산염 완충 식염수에서의 pH 7.34) 4 % 파라 포름 알데히드로 타이로드의에서 솔루션을 전환합니다.
7. 목과 꼬리의 증가 강성하여 조직의 좋은 고정을 모니터링합니다.
8. 마우스 목을 벨 조심스럽게 두개골에서 뇌를 해부하다.
   1. 코쪽으로, rostrally 두개골을 덮고있는 털을 당기고 머리, 지느러미 쪽을 안정시키기 위해 단단히 잡아.
   2. 안와 근육과 하부 광대뼈 아치를 쪼개다하는 궤도의 가장자리를 따라 아래쪽으로 절단 날카로운 메스를 사용.
   3. 머리 복부 쪽을 켜고 rongeur를 사용하여 부착 목 근육을 제거합니다. 첫 번째 척추 호감과 뇌간에서 제거합니다.
   4. , 달팽이관을 시각화 rongeur와 상부 측두골을 잡고 시간과 후두골 사이의 구멍을 만드십시오. 소뇌의 표면에서 후두골을 벗겨.
   5. rongeur와 코를 덮는 뼈를 분쇄. 조심스럽게 남아있는 정면을 제거하고 뇌의 표면이 손상되지 중시하여 뇌의 표면에서 뼈를 정수리. 궤도 지역에 특히주의하십시오.
   6. 머리 복부 쪽을 돌립니다. 뇌는 오직 두개골 신경을 통해 이제 연결, 두개골의 나머지 부분에서 아래로 슬라이드합니다. 사용 작은 가위는 후각, 광학 및 삼차 신경을 잘라. 이것은 뇌를 발표 할 예정이다.
9. 후 고정을 위해 4 ° C에서 하룻밤 4 % PFA 뇌를 놓습니다.
10. 조직 학적 분석 및 헤 마톡 실린 - 에오신 염색의 경우, 24 시간 동안 인산염 버퍼에 머리를 전송 한 후 내장 파라핀로 진행합니다.
11. (뇌가 튜브의 바닥에 가라 앉을 때까지) 면역 조직 학적 분석을 위해, 24 ~ 48 시간 동안 인산염 완충 식염수에 30 % 자당 용액에 두뇌를 전송
12. 종양 지역의 중간을 통해 반 섹션 뇌는, 상처를 배치아래로 동결 금형에 측면, 드라이 아이스 에탄올, 드라이 아이스 이소 펜탄 슬러리 또는 액체 질소로 냉동 임베딩 미디어 OCT (화합물) 및 플래시 동결에 포함합니다. 단면 및 염색 할 때까지 -80 ℃에서 냉동 블록을 유지합니다.

4.2) 파라핀의 헤 마톡 실린 - 에오신 염색은 고유 GBMs의 Histo-병리학 적 분석을위한 두뇌를 내장

1. 섹션 파라핀은 유리 슬라이드에 42 ° C의 물을 욕조에 떨어 마운트, 4 μm의 두께로 머리를 내장.
2. 크실렌 가득 세 슬라이드 용기의 시리즈를 통해 5 분 간격으로 전송 한 후이를 60 ° C의 오븐에서 10 분간 넣어서 의해 탈 paraffinize 슬라이드.
3. 2 분 동안 100 %의 에탄올을 한 번 반복하여 95 % 에탄올을 2 분 동안 반복 한 번, 70 % 에탄올을 2 분 동안 교반하고 물에 슬라이드를 전송할 : 에탄올 욕의 일련의 슬라이드 수화물.
4. 2 분 동안 해리스 헤 마톡 실린 가득 슬라이드 용기에 침적하여 슬라이드를 얼룩.
5. 물이 깨끗해질 때까지 수돗물에 씻어.
6. 딥 두 번 잉 용액 (0.1 % 중탄산 나트륨)에 슬라이드.
7. 슬라이드를 2 분 동안 수돗물에 서 보자, 다음 2 분 동안 80 % 에탄올로 전송할 수 있습니다.
8. 5 분 동안 에오신으로 채워진 용기에 침적하여 슬라이드를 얼룩.
9. (한 번 반복 한 번, 100 % 에탄올 2 분을 반복, 80 % 에탄올 3-4 강하, 95 % 에탄올 2 분) 에탄올 화장실의 일련의 슬라이드를 탈수.
10. 자일 렌의 3 연속 화장실, 3 분 각각으로 취소합니다.
11. 크실렌 기반 장착 매체 커버 슬립 및 이미징을위한 준비가 될 때까지 실온에서 평평한 표면에 건조 할 수 있습니다. 실온에서 보관하십시오.

드 노보 유도 GBMs의 분자 세포 특성에 대해 알아내는 보존 임베디드 두뇌의 4.3) 면역 조직 화학

1. , -80 ° C 저장 영역에서 냉동 블록을 검색 저온 유지 장치에 배치하고 온도가 30 분 동안 평형 수 있습니다.
2. 제 12-14 μm의 두께 섹션과는 양으로 대전 된 유리 슬라이드 위에 2 ~ 3 절을 탑재합니다. 다른 슬라이드에 인접한 섹션을 수집하여, 직렬 부분을 잘라. 이 종양 내 인접 조직 섹션에 다른 항체 염색을 할​​ 수 있습니다.
3. 조직을 잘 준수 수 있도록 단면 후 최소 1 시간 동안 건조기에서 건조 슬라이드.
4. 섹션을 포함하고 세척하는 동안 슬라이드에 머물 액체를 허용하는 슬라이드의 각 끝에 (소수성 마커) 소수성 장벽을 만듭니다. 0.1 % 트리톤 X와 인산염 완충 생리 식염수 용액으로 섹션 (PBS 0.1 % 송신)를 커버하고 부드럽게 조직을 Permeabilize 하시려면하는 수평 진탕 기에서 5 분 동안 흔들어. 두 번 반복합니다.
5. 부드럽게 흔들면서 30 분 동안 비특이적 (차 항체가 발생시킨 동물로부터 혈청) 10 % 정상 염소 혈청의 용액으로 결합 차단
6. PBS에 0.​​1 %를 2 % 정상 염소 혈청에서 일차 항체 솔루션을 준비Tx 및이 섹션을 통해 솔루션을 피펫. 어둠 속에서 덮여 습기 챔버에서 슬라이드를 놓고 실온에서 하룻밤 유지.
7. 다음날, PBS 0.1 % Tx는 5 분 동안 절을 세 번 씻어 1 시간 동안 2 % 정상 염소 혈청 PBS 0.1 % 송신에 희석 형광 이차 항체에 품어.
8. 형광을 유지합니다 설치 매체를 기반으로 물로 세척 한 번 더 맑은 물과 커버 슬립에, 2 분 동안 핵 얼룩 (예를 들어, DAPI)와 Counterstain과 PBS 0.1 % Tx는 5 분 동안 절을 세 번 씻으십시오. 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 그들을 이미징을위한 준비가 될 때까지, 어둠 속에서, 최소 24 시간 동안 치료 할 수 있습니다. 4 ° C에서 후 보관하십시오.

특정 유전자 개조와 차 종양 세포주의 5 세대.

1. 뷰티 종양 베어링 마우스 잠자는에서 세포 라인을 생성하려면 확인 큰 종양 (생물 발광 (10) ⁷ -10 ⁸ 광자 / S / cm와 마우스를 선택2 / SR).
2. (4 절에 설명 된대로) 두개골에서 뇌를 해부 신중하게, 이소 플루 란 마취의 과다 복용으로 마우스를 안락사 동물의 목을 벨합니다. 깨끗한 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다.
3. 면도날을 사용하여, 종양 관상 컷 전후방을 만든다. 종양의 위치로 인해 뇌의 투명성 통상 인식 할 수있다.
4. 미세 집게로 직경 종양, 보통 5-7mm를 해부 300 μl의 신경 줄기 세포 미디어 가득 1.5 ML 튜브에 배치 (NSC 미디어는 : B-27 보충, N2 보충 및 Normocin와 DMEM / F12, 보충 20 NG의 농도로 인간 재조합 EGF와 bFGF를 / ㎖ 각).
5. 부드럽게 튜브의 벽에 맞는 플라스틱 유봉과 종양을 균질화.
6. 효소가없는 조직 해리 용액 1 ㎖를 첨가하고, 5 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
7. , 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액에 합격하여 10 mL로 여과기를 세척NSC 미디어, 4 분, 캔트 상층 액과 300 XG에 원심 분리기 NSC 매체의 7 ml의에 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
8. 95 % 공기 및 5 % CO _2의 조직 배양 인큐베이터와 함께 분위기에서 37 ° C에서 배양 용 T25 플라스크 배양 접시 상. 삼일 후 일부 세포는 일부는 배양 접시의 바닥에 부착, 사망, 일부는 자유롭게 미디어에 떠 형성 neurosphere를합니다.
9. T75 조직 배양 플라스크에이 일시 중단 된 세포와 다시 플레이트를 제거합니다.
10. 문화의 또 다른 삼일 후, neurosphere를 수집, 단계 5.6에 설명 된대로 셀 스트레이너를 통해 긴장을 해리와 세포를 계산합니다. T75 플라스크 FGF와 EGF에 대한 보충 NSC 14 ㎖ 중의 백만 세포의 밀도로 소 태아 혈청, 10 % DMSO에서 세포와 세포의 통과 분취 액을 동결. 성장률은 종양을 생성하기 위해 사용될 종양 유전자에 의존 할 것이다. 과증식을 방지하고 비교적 높은 밀도로 세포를 유지하는 세포 배양 조건을 적응.

결과

SB 유도 된 아교 모세포종의 histo 병리학 적 특징을 특성화하기 위해, C57 / BL6 신생아 생쥐 플라스미드 종양 DNA, 즉, NRAS (PT / CAGGS와 트랜스포존을 코딩과 조합 코드하는 플라스미드 루시페라아제 (PT2 / SB100x 뤽)와 P1으로 주입하면서 -NRASV12)와 SV40 LG 텔레콤 (PT / CMVSV40-LGT) (도 3c) 또는 PDGFβ 짧은 머리 핀의 자형으로 p53의와 NRAS (그림 3D와 함께 GFP 기자 (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ...

토론

이 글에서, 우리는 세부 사항 신생아 마우스의 뇌실 영역을 주변 세포에 종양 플라스미드 DNA의 SB의 transposase- 매개 통합을 사용하여 GBM의 새로운 모델을 생성하기위한 다양하고 재현하는 방법. 우리가 관심있는 새로운 유전자 트랜스포존 플라스미드를 생성하는 프로토콜을 제시, 살아있는 동물에서 종양의 진행을 모니터링하는 방법, 및 이들의 종양 histo 병리학 및 면역 조직 화학적 특징을 특성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors	Stoelting	51670	Other companies produce similar frames, any of them with small mouse adaptors are suitable
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Injections can be made without it, ,but    the automatic injector allows for increased reproducibility and convenience
10 μl 700 series hand fitted MICROLITER syringe	Hamilton	Model 701	This syringe model will deliver from 0.5 to 500 ul of solution reliably. Other syrnges (fro example 5 ul, Model 75) may also be used
30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)	Hamilton	S/O# 197462	This needle is ideal to pierce the skin and the skull of a neonatal mouse without the need of other invasive procedures. If it gets dull (doesn't easily enter the skin), it needs to be replaced.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Aliquot in small volumes and keep at -20 oC
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio.com	LuckK-1g	Other sources of firefly lucifierase are just as adequate
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01	For embedding brains for cryosectioning and immunohistovhemistry
Advanced DMEM/F-12, no glutamine	Life Technologies	12634-010	For the culture of neurospheres
B-27¨ Supplement (50X), serum free	Life Technologies	17504-044	Serum free supplement for the culture of neurospheres
N2 Supplement (100x)	Life Technologies	17502-048	Serum free supplement for the culture of neurospheres
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Anti-mycoplasma agent for the culture of neurospheres
Recombinant Human EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
Recombinant Human FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Growth factor supplement for the culture of  neurospheres
[header]
HyClone HyQTase  Cell Detachment Reagent	Thermo Scientific	SV3003001	For the dissociation of neurospheres
Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749510-0590	For the dissociation of freshly dissected tumors
Falcon Cell Strainers mesh size 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	For generating single cell suspensions of dissociated neurospheres
Xylenes Histological grade	Fisher Scientific	C8H10
Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)	Fisher Scientific	245-678
Protocol Eosyn Y Solution (intensified)	Fisher Scientific	314-631