Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Resumen

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Resumen

El estrés oxidativo, que es el resultado de un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación de especies reactivas del oxígeno, es un importante contribuyente a trastornos humanos crónicas, incluyendo enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas, diabetes, envejecimiento, y cáncer. Por lo tanto, es importante para estudiar el estrés oxidativo no sólo en sistemas celulares, sino también el uso de organismos enteros. C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la genética de las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, que se conservan altamente evolutivamente.

Aquí, ofrecemos un protocolo para medir la resistencia al estrés oxidativo en C. elegans en líquido. Reactivos Brevemente, ROS inductores como el paraquat (PQ) y H ₂ O ₂ se disuelven en tampón M9, y las soluciones se dividen en partes alícuotas en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. L4 Sincronizada / joven C. elegans animales se transfieren a los pocillos (5-8 animales / pocillo) y se mide la supervivenciacada hora hasta que la mayoría de los gusanos están muertos. Cuando se realiza un ensayo de resistencia al estrés oxidativo usando una baja concentración de factores de estrés en las placas, el envejecimiento podría influir en el comportamiento de los animales sobre el estrés oxidativo, lo que podría dar lugar a una interpretación errónea de los datos. Sin embargo, en el ensayo descrito en el presente documento, este problema es poco probable que ocurra ya que se están utilizando sólo L4 / animales adultos jóvenes. Por otra parte, este protocolo es de bajo costo y los resultados se obtienen en un día, lo que hace que esta técnica atractiva para pantallas genéticos. En general, esto le ayudará a entender las vías de transducción de señales de estrés oxidativo, lo que podría traducirse en una mejor caracterización de los trastornos humanos con el estrés oxidativo asociado.

Introducción

En eucariotas, la fosforilación oxidativa que tiene lugar en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria es el principal motor de la producción de energía en forma de ATP. Especies reactivas del oxígeno (ROS) son un subproducto natural de este proceso. A pesar de su importante papel como moléculas de señalización, excesiva ROS puede conducir a daños en el ADN, carbonilación de proteínas, y la oxidación de los lípidos. Un desequilibrio entre la producción y la desintoxicación ROS causa el estrés oxidativo, que conduce a agotamiento de la energía, el daño celular, y desencadena la muerte celular ^1,2. El estrés oxidativo contribuye al envejecimiento y al desarrollo de muchas enfermedades que amenazan la vida, incluyendo cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas ^3-9.

Las células han desarrollado estrategias de defensa enzimáticos y no enzimáticos para mantener los niveles de ROS adecuadas y para proteger a sus electores contra el daño oxidativo ^1,2. La superóxido dismutasa (SOD) enzimas actúan primero en convert superóxido a H ₂ O _2, que más tarde se convierte en el agua por la catalasa o enzimas peroxidasa. Estrategias para no enzimáticos de defensa incluyen principalmente moléculas que reaccionan más rápidamente con ROS en comparación con macromoléculas celulares, protegiendo los componentes celulares esenciales. A pesar de la función protectora de ROS desintoxicación enzimas, algunas moléculas ROS escapan los mecanismos de defensa antioxidante y conducen al daño oxidativo. Detección, reparación, y la degradación de los componentes celulares dañados son estrategias esenciales de defensa durante el estrés oxidativo ^1,2.

Vías de señalización implicadas en la resistencia a la tensión y el estrés oxidativo en concreto son altamente conservadas evolutivamente ^10,11. A diferencia de los experimentos de cultivo de células, donde las condiciones organismal son sólo parcialmente reproducidos, el estudio del estrés oxidativo en organismos modelo ^12,13 tiene un gran significado. C. elegans es un nematodo de vida libre que puede ser fácil y económicamente culrado en un césped de bacterias en medios de agar. Es de tamaño pequeño (alrededor de 1 mm de longitud) y normalmente crece como un hermafrodita auto-fertilización, lo que facilita las manipulaciones genéticas. Tiene un ciclo de vida rápido y una alta capacidad reproductiva, produciendo aproximadamente 300 crías por generación, por lo que es una poderosa herramienta para realizar cribados genéticos a gran escala ^14. El C. elegans genoma está completamente secuenciado y el 40-50% de los genes se predice para ser homólogos de genes asociados a enfermedades humanas ^15-18. La caída de los genes de interés utilizando RNAi es rápida y fácil en C. elegans. génica por la regulación se puede lograr mediante la alimentación de animales de la E. bacterias coli que albergan un plásmido que expresa el ARN de doble cadena que se dirige el mRNA de interés ^19. Por lo tanto, la determinación de la función de genes utilizando pantallas de RNAi gran escala tiene un gran impacto en la comprensión de las enfermedades humanas como el cáncer ^20,21.

Estudios de oresistencia al estrés xidative en C. elegans han conducido a la identificación de conservados mecanismos de resistencia al estrés oxidativo ^13,22. Algunas vías identificadas son vías comunes que modulan la longevidad y la resistencia a otros factores de estrés, así como la hipoxia, el calor, y el estrés osmótico. Estas vías incluyen la señalización de la insulina, la señalización de TOR y la autofagia. Otras vías importantes implican la desintoxicación de ROS como las enzimas superóxido dismutasa y catalasa enzimas, o en la reparación de daños tales como choque térmico y chaperón proteínas ^11,13,22.

Este protocolo describe cómo determinar la resistencia al estrés oxidativo de C. elegans en líquido. Utilizamos FLCN-1 (ok975) y de tipo salvaje animales para demostrar el protocolo ya que hemos demostrado anteriormente una mayor resistencia al estrés oxidativo sobre la pérdida de FLCN-1 (ok975) en C. elegans ^23. También hemos demostrado que este aumento de la resistencia dependeen AMPK y la autofagia, un eje de señalización que mejora la bioenergética celular y promueve la resistencia al estrés ^23. PQ es un factor de estrés oxidativo que interfiere con la cadena de transporte de electrones para producir especies de oxígeno reactivo ^24. El mismo ensayo se podría adaptar y otras fuentes de ROS o compuestos que generan ROS podría ser utilizado como H ₂ O ₂ y rotenona. Ensayos similares se han desarrollado en las placas donde se utilizan bajas concentraciones de PQ ^25,26. La ventaja de este ensayo es que es muy rápido, y los resultados se podría obtener en un día. Además, el volumen total de líquido usado para llevar a cabo el ensayo de la resistencia al estrés oxidativo en placas de 96 pocillos es baja en comparación con el volumen utilizado para preparar placas PQ-que contienen. Por lo tanto, la cantidad de PQ es utilizado en el ensayo de líquido es bajo, lo que hace que el ensayo de bajo costo y limita la producción de desechos tóxicos. Sin embargo, las limitaciones de este ensayo en comparación con los ensayos de placa incluyen el lack de comida en el ensayo de líquido y la menor concentración de oxígeno en el líquido en comparación con el aire. Estos son factores importantes que en algunos casos, podrían influir en los resultados. Por lo tanto, lo que confirma la reproducibilidad utilizando otros métodos de la resistencia al estrés oxidativo se recomienda para apoyar los resultados obtenidos en este ensayo.

Protocolo

1. Preparación de los reactivos

1. Preparación de los medios de comunicación para C. crecimiento elegans (en este caso, los animales de tipo salvaje y los animales FLCN-1 (ok975) mutantes).
   1. Prepárese Modificado Sólo Bacto-peptona (MYOB) mezcla seca de Youngren que contiene 5,5 g de Tris HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl y 0,08 g de colesterol. Mezclar bien con agitación.
      NOTA: Esta mezcla es suficiente para preparar 10 litros de medio MYOB.
      NOTA: placas de medio de crecimiento normal (NGM) podrían utilizarse en lugar de placas de ²⁷ MYOB. Sin embargo, el mismo tipo de placas se debe utilizar para comparaciones válidas entre las cepas y entre repeticiones independientes. En este protocolo, sólo utilizamos placas MYOB.
   2. Preparar 1 l de medio MYOB añadiendo 6 g de MYOB mezcla seca, 17 g de agar y completar hasta 1 l con _H2O y autoclave durante 45 minutos a 122 ° C. Verter en las placas y dejar secar a temperatura ambiente durante 2 días.
   3. Utilizando una técnica estéril, inocular 100 ml de culture de medio de caldo LB con E. bacterias coli OP50 y crecen O / N a 37 ° C.
   4. Placas MYOB Semilla con E. bacterias coli OP50. Deje que crezca a temperatura ambiente durante 48 horas.
2. Preparación para la regulación a la baja de genes utilizando RNAi
   1. Preparar platos RNAi alimentación MYOB. Proceda como en los pasos 1.1.1 y 1.1.2. Después de la esterilización en autoclave, deje que el medio se enfríe a aproximadamente 55 ° C y añadir 1 ml de 1 M isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y 1 ml de ampicilina 100 mM.
   2. Streak E. coli HT115 bacterias transformadas con un plásmido, que expresa ya sea de control o FLCN EV-1 RNAi específica sobre ampicilina (50 mg / ml) / tetraciclina (15 g / ml) en placas de agar. Crecer cultivo O / N a 37 ° C.
   3. Escoja colonias e inocular E. coli HT115 bacterias transformadas con un plásmido que expresa ya sea de control o FLCN EV-1 RNAi específica y crecen en cultivo LB / ampicilina (50 mg / ml) a medio y O / N a 37 & #176; C.
   4. Placas de semillas con E. coli HT115 EV bacterias o HT115 FLCN-1 RNAi bacterias.
      NOTA: Mantenga las placas de 48 horas a temperatura ambiente antes de su uso. Si RNAi desmontables por la alimentación es en efectivo, utilice otros métodos de entrega de la ds-RNA ^28.
3. La inducción de estrés oxidativo usando paraquat (PQ):
   1. Preparar tampón M9 mediante la mezcla de 3 g de KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl y 0,25 g de MgSO ₄ · 7 H ₂ O. Llevar hasta 1 L con agua destilada. Autoclave solución durante 45 minutos a 122 ° C botellas y almacenar a temperatura ambiente.
   2. En el día del ensayo, preparar la solución de M9 / PQ-que contiene. Para este protocolo, utilizar mM PQ 100 (0.1028 g de PQ disuelto en 4 ml de tampón M9 llena toda una placas de 96 pocillos con 40 l de M9 / PQ por pocillo).
      PRECAUCIÓN: PQ es un compuesto peligroso y altamente tóxico. Manipular de acuerdo con las directrices apropiadas.
      NOTA: Cuando se ejecuta primero un nuevo stren o una nueva condición, se recomienda analizar la supervivencia en concentraciones crecientes de PQ para determinar la mejor concentración para utilizar con el fin de matar a los animales dentro de 7 a 10 h.

2. Preparación de sincronizada-Edad L4 Población

1. Transferencia 20 adultos hermafroditas grávidas a una placa MYOB fresco sembrado con E. bacterias coli OP50. Preparar varias placas basadas en el número de gusanos necesarios durante el ensayo.
2. Deje que se ponen huevos durante 6 horas y luego utilizando un gusano alambre de platino pick de quitar las madres. Compruebe las placas bajo el microscopio para evaluar el número de huevos puestos.
3. Permita que los huevos eclosionan y crecen a 20 ° C durante 48 horas. En este momento, los animales están en un estado adulto finales L4 / joven. Escoja mismos animales de escenario y la transferencia a los pozos que contienen solución-PQ.
   NOTA: Desde 48 horas de incubación sólo se aplica a los mutantes que crecen de manera similar a los animales de tipo salvaje, es importante vigilar el desarrollotasa de mutantes recién probado para asegurar que se ajusta a la tasa de desarrollo de tipo salvaje, de lo contrario, deben utilizarse otras líneas de tiempo.
4. Alternativamente, utilizar técnicas de sincronización. Generar población sincronizada de L1 gusanos larvas utilizando una solución de hipoclorito (25 ml de agua, 125 ml de 5,25% de hipoclorito de sodio, 50 ml de 4 M de NaOH; envuelva botella con papel de aluminio para aislar de la luz). Sin embargo, para este ensayo, no se recomienda, ya intensa blanqueo podría afectar el comportamiento de los animales durante el ensayo.
   PRECAUCIÓN: Manipular solución de hipoclorito de acuerdo con las directrices.
   NOTA: Al usar el ARNi para regular por el gen de interés, sincronizar los hermafroditas como se describe en la sección 2, con la excepción de la transferencia de las madres a las placas de RNAi sembradas con la bacteria específica RNAi. Cuando la caída con el ARNi es débil, se recomienda la alimentación para varias generaciones.

3. Realizar el estrés oxidativo Resistencia Ensayo

1. Pipetear 40 l de la solución 100 mM PQ (preparado fresco) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Utilice al menos 12 pozos como repeticiones de cada condición (tratamiento, mutante, etc.). El uso de un gusano selección alambre de platino, transferir 5-8 animales larvas L4 a cada bien indicando la hora de inicio y la hora de finalización.
2. Al iniciar otra condición, tenga en cuenta el tiempo de inicio y la hora de finalización. Colocar la placa a 20 ° C en el tiempo de incubación entre la transferencia de los gusanos y anotando animales muertos una hora después de la hora de inicio.
3. Utilizando el microscopio de disección, cuente la supervivencia cada hora. Agite suavemente la placa antes de comenzar a contar. Indique gusanos que no se mueven, incluso después de ver una luz de alta intensidad, como animales muertos. Asimismo, indique el número de animales vivos.
   NOTA: En cuanto a la forma de gusano, las colas y el movimiento de la cabeza en la alta ampliación, ayudar a determinar gusanos muertos de vida.
4. Repita este paso cada hora hasta que la mayoría de los gusanos están muertos.

4. Determinación del porcentaje de supervivencia en Every Time Point

1. Calcular el número total de animales por condición sumando el número total de animales transferidos a cada pocillo. No haga caso de los animales que se encuentren dañados o muertos tras la transferencia.
2. Por cada punto de tiempo, calcular el número total de animales muertos por enfermedad (suma de los animales muertos en los 12 pozos). Por cada punto de tiempo, calcular el porcentaje de mortalidad (número de animales muertos dividido por el número total de animales y multiplicado por 100) y porcentaje de supervivencia (100 menos ciento muerte).
3. Repita este ensayo de al menos 3 veces independientes.

Resultados

La comparación de tipo salvaje C. elegans para FLCN-1 (ok975) animales mutantes

Aquí hemos utilizado PQ 100 mM para determinar la resistencia de tipo salvaje C. elegans animales en comparación con FLCN-1 (ok975) que se ha demostrado para resistir el estrés oxidativo, el calor y la anoxia ^23. Después de 4 horas de tratamiento, el 48,3% de los de tipo salvaje sobrevivido en comparación con el 77,8% de supervivencia en-1 FLCN (ok975)...

Discusión

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar la resistencia al estrés oxidativo genéticamente in vivo, ya que puede ser fácilmente cultivada, y rápidamente conduce a un gran número de descendencia genéticamente idéntica. Múltiples métodos para medir la resistencia al estrés oxidativo se han descrito anteriormente y se basan en la administración de suplementos de placas de cultivo con varias fuentes de ROS tales como PQ, rotenona, H ₂ O _2, y juglone ^25,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar bacteriological grade	Multicell	800-010-LG
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Sodium chloride biotechnology grade	Bioshop	7647-14-5
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride	Invitrogen	15506-017
Tris aminomethane	Bio Basic Canada Inc	77-86-1
IPTG	Santa Cruz Biotechnology	sc-202185A
Ampicillin	Bioshop	69-52-3
Yeast extract	Bio Basic Inc.	8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate	Aldrich chemistry	856177-1G
Petri dish 60x15mm	Fisher	FB0875713A
Pipet 10ml	Fisher	1367520
Potassium phosphate monobasic	G-Biosciences	RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma	M-5921
Sodium phosphate dibasic	Bioshop	7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source	Ahringer Library