שימוש ב- MRI שדה Ultra-גבוה במודלים של מכרסמים קטנים של מחלת כליות פוליציסטיות ל<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור phenotyping ותרופות

Summary

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Abstract

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Introduction

מחלת כליות פוליציסטיות (PKD) כוללת קבוצה של הפרעות monogenic מאופיינות בהתפתחות ציסטות כליות. ביניהם אוטוזומלית דומיננטי מחלת כליות פוליציסטיות (ADPKD) ומחלת כליות פוליציסטיות אוטוזומלית רצסיבית-(ARPKD), המייצג את הסוגים הנפוצים ביותר הם ^1,2. ADPKD, הצורה השכיחה ביותר של מחלות כליה תורשתיות פיברוזיס, הוא מקור על ידי מוטציות בגנים PKD1 או PKD2. הוא מאופיין על ידי הופעה מאוחרת, ציסטות כליות דו צדדיות מרובות, מלווה בציסטות במיוחד כליות משתנה, כמו גם חריגות שלד לב וכלי דם ושרירים. ARPKD, רוב התינוקות בדרך כלל משפיעים על ילדים ובני נוער, נגרמים על ידי מוטציות בPKHD1 ומאופיינת בכליות echogenic מוגדלות וסיסטיק הכבד המולדים ^3.

חשוב לציין, במחלה מאופיינת בהטרוגניות, שניהם בגן (genic) ומוטציה (האללים) רמות, מה שגורם בעמ המשמעותיהשתנות henotypic. מוטציות בגן PKD1 משויכות מצגת חמורה קלינית (ציסטות רבות, אבחון מוקדם, יתר לחץ דם, והמטוריה), כמו גם התקדמות מהירה לסיום שלב מחלת כליות (20 שנים מוקדם יותר מחולים עם מוטציות PKD2) ^4. מחלה קשה פוליציסטיות כבד (PLD) ומומים של כלי דם יכולים להיות קשורות למוטציות בשני PKD1 וPKD2 ^5. רוב סיבוכי כליות של ADPKD נובעים בעיקר כתוצאה מהרחבת ציסטה יחד עם הדלקת ופיברוזיס קשורים. פיתוח ציסטה מתחיל ברחם וממשיך דרך החיים מטופל. כליות בדרך כלל לשמור על צורתם reniform למרות שהם יכולים להגיע ליותר מ 20 פעמים נורמלי כליות נפח. רוב ההפצה דו-צדדית הנוכחית החולים של ציסטות כליות, אך במקרים יוצאי דופן, ציסטה עלולה להתפתח בתבנית חד-צדדית או א-סימטרית.

Challen גדולGE לנפרולוגים הבא חולים עם ADPKD או יישום טיפולים הוא ההיסטוריה הטבעית של המחלה. במשך רוב מסלולו, התפקוד הכלייתי נותר נורמלי ועד שהתפקוד הכלייתי מתחיל לרדת, רוב הכליות הוחלפו בציסטות. כאשר טיפולים מבוצעים בשלבים מאוחר יותר, זה פחות סביר להיות מוצלח מאז החולה עלול כבר הגיע לנקודת האל-חזור במחלת כליות כרונית. לעומת זאת, כאשר טיפולים הם התחילו בשלבים מוקדמים, קשה לזהות תגובה מבוססת אך ורק על קצב סינון גלומרולרי. כתוצאה מכך, הרעיון של כליות נפח כסמן של התקדמות מחלה זכה לתשומת לב.

קונסורציום לradiologic הדמיה מחקרים של מחלות כליה מחקר פוליציסטיות (פריך) הראה כי בחולים עם ADPKD הגידול במחזורים בכליות וציסטה ישירות בקורלציה עם הידרדרות בתפקוד הכלייתי, מדגיש את הפוטנציאל של נפח הכולל כליות (TKV) כמוסמן urrogate ^ל6,7 התקדמות מחלה. כתוצאה מכך, TKV משמש כיום כנקודת סיום ראשונית או משנית בניסויים קליניים מרובים לADPKD ^2,8,9.

מודלים עכברי מרובים כוללים מוטציות ספונטניות ומהונדסות גנטי שפכו אור על הפתוגנזה של PKD ^10,11. מודלים Pkd1 או Pkd2 (מוטציות בשני Pkd1 או Pkd2) הפכו הפופולרי ביותר, כפי שהם מחלות של בני אדם לחקות בצורה מושלמת. בנוסף, מודלים של מכרסמים עם מוטציות בגנים אחרים מאשר גני Pkd1 או Pkd2 שימשו כפלטפורמה ניסיונית להבהיר מסלולי איתות הקשורות למחלה. בנוסף, כמה ממודלים אלה היו בשימוש כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים. עם זאת, גורם מגביל במחקרים במכרסמים רבים לPKD הוא לעתים קרובות חוסר שיטות לא פולשנית יעילים לנתח רצף השינויים אנטומיים ותפקודיים בכליות.

r המגנטיההדמיה esonance (MRI) היא טכניקת ההדמיה תקן זהב הנוכחית לעקוב חולים במחלה, מתן ניגוד רקמות רכות מעולה ופרטים אנטומיים, ומאפשר מדידות TKV. למרות שהבדיקה MRI היא מבוססת היטב להדמיה אנטומית בבעלי חיים גדולים יותר ובני אדם, מכרסמים קטנים הדמיה in vivo כרוך אתגרים טכניים נוספים, שבו היכולת לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה עלולה להגביל את השימושיות שלה. עם כניסתה של אולטרה-גבוה שדה (UHF) MRI (7-16.4 T) והפיתוח של שיפועים חזקים, ניתן כיום להשיג גבוה אות לרעש יחס ורזולוציה מרחבית של תמונות MRI עם איכות אבחון דומה לזה הושג בבני אדם. כתוצאה מכך, השימוש בUHF MRI הדמיה in vivo של מודלים של מכרסמים קטנים לPKD הפך לכלי רב עוצמה לחוקרים.

Protocol

לפני תחילת כל הליכים עם בעלי חיים, צריכים להיות מאושרים על פרוטוקולי ניסוי על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי החיים ושימוש (IACUC).

1. סורק תצורה

1. לפני שתתחיל, ודא דוד הוא במצב OFF.
2. בחר את שיפוע מיני ההדמיה וסליל RF 38 מ"מ ובעל הדמיה מיני.
3. בנישא של בעל המרכזי התקן את מכלול הטמפרטורה משתנה.

2. הכנת בעלי החיים

1. לניסויי MRI, להשיג הרדמה אופטימלית באמצעות isoflurane מתאדה. לאינדוקציה של הרדמה, למקם בעלי חיים בתא אינדוקציה מרופד ברקמות סופגת. התאם את מד הזרימה של מאדה isoflurane ל2.0-2.5 ליטר / דקה, וisoflurane עד 3% בחמצן.
2. הסר את כל תג מתכת או חפץ מתכתי אחר בשלב זה. החל משחה וטרינר בעיניים של בעלי החיים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
3. ברגע שבעלי החייםהגיע המטוס של הרדמה כירורגית (כלומר, אובדן של רפלקס נסיגה לקמצוץ הבוהן), למקם את החיה על בעל עם אפה מוכנס לתוך חרטום. הגדר את זרימת האוויר בהרדמת הבדיקה ל2.0-2.5 מיליליטר / דקה וריכוז isoflurane ל1.5-2.0% בחמצן. הרדמה תימסר באמצעות החרטום במהלך ההליך. מעת לעת להתאים ריכוז isoflurane בהתאם לגילו של בעל החיים ולשמור על משקל קצב נשימה של ~ 40 פעימות לדקה.
4. השתמש מחזיקי בעלי חיים כדי לאבטח את בעלי החיים במקום ולמנוע תנועה במהלך ניסוי MRI. להשתנות הסוג של בעל חיים בהתאם לאזור בגוף לסריקה.
   הערה: הבעלים מותאמים אישית מפלסטיק מעבדה (פוליפרופילן, טפלון, פוליסטירן, פוליקרבונט) יכולים להתבצע כדי להתאים ניסוי ספציפי וכדי להתאים את גודל החיה (מעכבר שזה עתה נולד לחולדות 160 ז).
5. מניחים את מדחום רקטלי בבעלי החיים כדי לפקח על טמפרטורת הגוף של בעלי החיים. במהלך Experiment, לשמור על בעלי החיים ב35-37 מעלות צלזיוס, באמצעות זרם של אוויר חם. התאם טמפרטורת אוויר (30-38 מעלות צלזיוס) וזרימה (HR / 1,200-2,000 L) המבוסס על משוב טמפרטורת גוף של בעלי החיים.
6. צרף חיישן לחץ נשימה בלון לבטן של החיה כדי לפקח על קצב נשימה.
7. אבטח את החיה במרכז סליל RF ולמקם את סליל RF עם בעלי חיים לסורק MRI בזהירות.

ניסוי 3. MRI

1. מנגינה ולהתאים את סליל RF לפני תחילת הניסויים כדי למזער כוח RF משמש ועל מנת למקסם את יחס אות לרעש. כדי להפעיל את ההתאמה / הכוונון:
   1. פתח את כלי שליטת ספקטרומטר ידי לחיצה על סמל הכלים.
   2. בכלי שליטת ספקטרומטר לחץ רכישת → לנענע. חלון ACQ / Reco יפתח בו מוצגות העקומה לנענע.
   3. לחלופין להתאים את קבלי כוונון והתאמה (באמצעות הכוונון והתאמת מוטות) בצעדים קטנים עד שכוח RF משתקףממוזער. המטרה היא לראות עקומה עם מינימום בציר האנכי ממוקם באפס על הציר האופקי.
   4. כאשר הכיול של הסליל הושג בהצלחה, לחץ על כפתור העצירה בחלון ACQ / Reco.
2. לרכוש תמונות צופים בשלושה מטוסים מאונך כדי ליצור תמונות ציריות, עטרה ועל sagittal. השתמש רצף תמונה מהיר כגון Shot זווית נמוכה מהירה (IG-FLASH) תוך השער לרכוש את תמונות הסקאוט ^12. השתמש בתמונות הסקאוט להגדיר את הגיאומטריה הנכונה להדמיה בפועל.
3. בהתאם למטרות המחקר הספציפיות, בחר תמונה ברצף נכון ופרמטרים ולהתחיל בסריקה עם רמזור. זה לכייל ערוץ RF, שים את מגנט תדר הנושא מוגדר, על-תהודה למים ולהתאים את רווח מקלט, כל באופן אוטומטי.
   1. ללימודים אנטומיים ותמונות משוקללים T2, לרכוש בפרוסה רבת 2D או 3D מצב. כדי לקצר את זמן הניסוי לרזולוציה מרחבית נתון, לשמור על השדהמעריך-נוף (FOV) קטן ככל האפשר, אך גדול מספיק כדי להימנע מחפצים בניילון סביב (2.56-3.2 סנטימטרים).
4. שמור את המחזור של רצף נבחר מעט קצר יותר מאשר מחזור הנשימה של בעלי החיים על ידי בחירה נכונה של זמן החזרה (TR) ו / או מספר פרוסות. הדבר מבטיח כי הנתונים שנאספו במהלך התקופה השקטה "בעלי החיים.
   1. לדוגמא, עבור תמונות בטן, לשמור על קצב הנשימה של החיה ב ~ 30 פעימות לדקה; שהוא כ -2,000 אלפיות שניים לנשימה. השתמש טורבו מהירה רכישה עם שיפור ההרפיה רצף (נדיר) ולרכוש 11-19 פרוסות עטרה, עם TR / 1500/9 msec TE, גורם נדיר 8 ו( מטריצה ​​256 x 256, FOV 2.56 x 2.56 סנטימטר, עובי פרוסה 0.75 מ"מ) .
      הערה: על ידי התאמת TR 1,500 אלפיות שניים, ושמירה על קצב הנשימה של החיה ~ 30 פעימות לדקה (2,000 אלפיות שניים לנשימה), אנו מבטיחים כי הנתונים שנאספו במהלך התקופה השקטה "בעלי החיים.
5. אחרי הכל רכישת התמונה הושלמה, למקם את החיה שנסרקהעל משטח לוהט ולפקח עד אמבולטורי. לאחר התאוששות, להחזיר את בעלי החיים לכלוב ופיקוח לפחות עבור שעה 1 לפני ההחזרה למתקן בעלי החיים.

תוצאות

בכתב היד הזה, אנו שואפים להראות את התועלת של UHF MRI ככלי לאפיון in vivo phenotypical או ניטור תרופה במודלים של מכרסמים לPKD ומחלות כליה אחרות. כל הניסויים היו חלק מפרוטוקולי ניסוי אושרו על ידי IACUC.

בphenotyping vivo של מודלים של מכרסמים קטנים ל...

Discussion

כתב יד זה מראה את הכדאיות של שימוש UHF MRI ככלי לאפיון in vivo phenotypical או ניטור תרופה במודלים של מכרסמים לPKD.

אנו מתארים ניסויים שנעשו ב16.4 T עם שעם רחב ספקטרומטר תמ"ג ברזולוציה גבוהה Avance III מצויד באבזרי הדמיה מיקרו ומיני. ספקטרומטר ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVANCEIII-700 (16.4 T)	Bruker	BH067206	Wide-bore two channel multinuclear spectrometer equipped with mini and micro-imaging accessories for in vivo small rodent imaging
TopSpin2.0PV	Bruker	H9088TA2	Spectrometer processing software
Paravision 5.1	Bruker	T10314L5	Imaging sofware
VTU BVT 3000 digital	Bruker	W1101095	Temperature controller