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요약

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

초록

우리는 금 나노 결정에서 방출되는 차동 형광 신호에 기초하여 약물 - 로딩 단백질 내의 형광 금 나노 클러스터 (금 나노)를 형성함으로써 표적 단백질에 작은 약물 분자의 결합 친화도를 결정하기위한 새로운 약물 스크리닝 방법을 보여준다. 인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 단백질은 알부민 단백질 모델로서 선택된다. 4 개의 작은 분자 약물 알부민 단백질에 다른 결합 친화도의 (예를 들어, 이부프로펜, 와파린, 페니토인 및 설파 닐 아미드)를 시험한다. 이는 변성 조건 (즉, 60 ° C 또는 우레아의 존재하에)하에 약물로드 알부민 단백질 내부 형광 금 나노 결정의 형성 비율은 (약물)없이 깨끗 단백질에 형성된 것보다 느리다는 것을 발견 하였다. 또한, 상기와 같은 나노 결정 형성의 형광 강도는 반비례 알부민이 단백질 약물의 결합 친화도에 상관 관계가 발견된다. 특히,금 나노 결정 형성 속도 느린 약물 - 단백질 결합 친 화성이 높은, 이렇게 얻어진 금 나노 낮은 형광 강도가 관찰된다. 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도 테스트 따라서 다른 약물의 상대적인 결합 강도의 단순한 측정을 제공한다. 이 방법은 단순히 고정 된 단백질의 단백질 농도로 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써, 특정 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)를 측정하기 위해 연장된다. 측정 결과는 다른 프레스하지만 더 복잡한 방법을 이용하여 얻어진 값과 잘 일치.

서문

인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)와 같은 혈청 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 혈액 구획의 삼투압을 유지하는데 중요한 역할을한다. 또한 스테로이드와 같은 낮은 수용해도의 소분자, 지방산, 갑상선 호르몬, 약물의 광범위한 담체 단백질로서 인식된다. 바인딩 재산권 알부민 혈청하는 이들 분자의 (예를 들어, 친 화성 또는 강도를 결합, 결합 부위)의 약동학에 중요한 주제를 형성한다. 1-4 여러 분석 방법과 같은, 알부민 혈청 상이한 약물의 결합 특성을 연구하기 위해 개발되어왔다 X 선 결정학, 5,6- 핵 자기 공명 (NMR), 7-11 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 12, 13 등 그러나, 이들 방법은 지루하고 시간 소모적 해석 처리 (하나에 의해 제한되는 예를 들면, X 선 crystallo위한 단결정 성장그래픽 연구), 전문 및 고가의 장비의 요구 사항 (SPR), 또는 검출을위한 비용이 많이 드는 동위 원소 표지 (NMR)을 필요로한다. 또한, 빨리 감기 직쇄, 비용 효율적인 방법으로 저분자 약물 스크리닝하는 다른 방법을 개발하는 것이 매우 바람직하다.

금 나노 클러스터 (금 나노)는 그들의 분리 및 크기에 의존하는 전자 구조, (18)에 그들은 광범위한 연구 관심을 받고있다 2 나노 미터. 14 ~ 17보다 작은 크기의 금속 원자의 수십 포함 된 나노 물질의 특별한 유형이다 20-23 이러한 독특한 재료의 특성, 특히 강한 형광이, 생물학적 시스템에서 감지 및 영상. 24-32 초소형 형광 금 나노 기능성 단백질을 사용하여 합성 할 수있는 등 다양한 응용 프로그램을 발견했다. (19)와 분자 등의 흡수 및 배출, 이러한 주형으로서 혈청 알부민 등. (33)의 전형적인 주형 단백질 합성 금 나노 결정은, 금 염 일정량 제 단백질 안에 캡슐화되고이어서 단백질 자체에 의해 감소​​된다. 단백질의 환원 능력은 알칼리성 용액의 pH를 증가시킴으로써 활성화 될 수있는 기능성의 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신) 성분에 기인한다. 단백질 구조의 전개는 금 나노 결정의 형성을위한 중요한 단계로 고려된다. 전개 된 단백질, 더 환원 관능기 캡슐화 금 염에 노출 될 수 있기 때문이다. 단백질 변성제에 열처리 또는 노광에 의해 달성 될 수 흘러 가고. 작은 분자 약물의 도입은 또한 중간 변성 온도 및 전개의 엔탈피를 수정 즉 전개 과정에 영향을 미칠 수있다. (34, 35) 이러한 모든 요인의 효과를 차례로 형광 금 나노 결정의 형성 반응 속도에 의해 반사 될 수 있으며 각성 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도. 36

e_content는 ">이 비디오는 높은 온도 (60 ℃)에서 약물 - 로딩 알부민 단백질의 Au 나노 결정을 합성 또는 변성제 (예를 들면, 우레아) 얻어진 금 나노 결정의. 형광 강도의 존재 하에서 약물의 스크리닝 방법을 보여 신호 판독이다. 먼저, 금 나노가 금 나노. 초의 형성 반응 속도에 영향을 미치는 단백질 (열처리 또는 변성제에 의해 유도) 흘러 가고 방법을 보여 60 ℃에서 또는 우레아의 존재하에 처리 된 HSA 및 BSA 템플릿에서 합성되어, 금 나노 결정은 다른 약제와 함께 미리로드 단백질 템플릿을 합성하고, 얻어진 금 나노 결정의 상대적 형광 농도의 약물 로딩 효과는 상대적인 결합 강도의 측정을 제공하는 연구된다. 마지막으로, Au로 NC 약물 선별 프로토콜을 위해 수정 될 고정 된 농도의 단백질에 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써 약물 - 단백질 결합 상수 (K D)의 정량적 측정.

프로토콜

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 화학 물질의 안전 보건 자료 (SDS)를 참조하시기 바랍니다. 약물 스크리닝 실험은 대량의 대응에 비해 추가 위험이있을 수 있습니다 나노 물질의 합성 및 처리를 포함한다. 확인하십시오 모든 필요한 통제 조치는 엔지니어링 컨트롤 (흄 후드) 및 개인 보호 장비 (PPE, 예를 들어, 안전 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발, 내 화학성 장갑, 안전 고글)의 사용을 포함, 실험을하는 동안 연습을한다.

약물 검사 용 화학 시약 1. 준비

  1. 금 나노 합성 전구체
    1. 금 (III) 클로라이드 용액을 15 mm로 제조 초순수 6.9 ㎖에 금 (III) 클로라이드 용액 (99.99 % 미량 금속 기준으로, 묽은 염산 30 중량. %) 30 mg을 용해. 주의 : 금 염화물 용액은 부식성과 자극성이다. 눈과 피부에 직접 접촉을 방지하기 위해 적절한 개인 보호구를 착용 할 것.
    2. 디초순수 1 ㎖의 HSA 또는 BSA의 ssolve 74 mg을 74 밀리그램 / 단백질 원액 ml의 준비를한다.
  2. 약액
    1. 목적하는 약물의 양, 예를 들면, (a) 이부프로펜 1.9 ㎎, (b) 와파린 2.8 ㎎, (c) 페니토인 2.3 ㎎, 450 mm의 제조 DMSO 20 μL의 (d) 술 파닐 아미드 1.5 ㎎을 용해 약물 재고 솔루션.
      주 : 이들 약물은 소수성이고 물에 난 용성이 때문에 DMSO 용매로서 선택된다.
  3. 기타 시약
    1. NaOH 용액 1.5 M을 제조 초순수 10ml에 수산화 나트륨 펠렛을 600 mg을 녹인다. 우레아 수용액의 20 M을 제조 초순수 2 ㎖에 우레아 2.4 g을 용해.

단백질 템플릿 형태 금 나노 2. 합성

  1. HSA-주형 금 나노 (HSA-금 나노)
    1. 두 개의 개별 온도 제어 자기 교반에 두 개의 유리 병, 거기에 마이크로 자기 교반 막대를 포함하는 각을 배치rers.
    2. 60 ° C로 한 마그네틱 스터 러의 온도를 설정하고, "60 ℃"로 그 위에 유리 바이알 라벨; 다른 자기 교반기는 그 위에 유리 바이알 "RT"로 표시되는 상온 (RT)에서 유지된다.
    3. 단백질 주형 내부 금 이온의 밀봉을 허용하도록 HSA 용액 200 μL, 초순수 200 μL, 및 (달리 명시하지 않는 한 360 RPM으로 설정) 일정한 교반 하에서 각각의 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 추가한다.
    4. 금 나노 결정을 형성 HSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하도록 2 분 후에, 각각의 바이알에 NaOH 용액 20 μL를 추가한다.
    5. 매 20 분, 384 웰 검은 판에 샘플의 각각의 솔루션의 50 μl를 그리는 마이크로 플레이트 리더와 발광 스펙트럼을 측정한다. 일반적인 스캔 설정 : - 850 nm의 λ 전 = 370 nm의은, λ EM은 410 =.
    6. 100 분 후 자석 교반기를 중지합니다.
    7. 싱크대에 흐르는 물에 유리 병을 쿨. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것.
    8. 각 샘플은 다른 온도 조건에서의 Au 나노 결정의 형성이 반응 속도를 획득하기 위해 모든 시점에서 광전자 스펙트럼 플롯.
  2. BSA-주형 금 나노 (BSA-금 나노)
    1. 자기 교반기 위에 마이크로 자기 교반 막대를 함유하는 유리 바이알을 놓는다. 실내 온도와 같은 온도를 남겨주세요.
    2. BSA 용액 200 μL, 우레아 200 μL, 일정한 교반하에 유리 바이알에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μL를 혼합한다.
    3. 2 분 후에, 금 나노 결정을 형성하기 위해 BSA의 환원 능력을 활성화하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작하는 NaOH 용액 20 μL를 추가한다. 시간당 반응 혼합물의 광전자 스펙트럼을 측정한다.
      주 : BSA - 금 나노 결정의 광전자 스펙트럼을 측정덜 빈번 BSA - 금 나노 결정의 형성 비율 인해 우레아 이하의 효과를 동일 온도에서 HSA-Au로보다 느리게하기 때문에 단백질을 전개한다.
    4. 7 시간 후 자석 교반기를 중지합니다. 요소의 변성에 의해 금 나노 결정의 형성 반응 속도를 볼 수있는 모든 시간에 광전자 스펙트럼을 플롯.

3. 작은 분자 약물 검사

  1. HSA에 다른 작은 분자 약물의 화면 상대 결합력
    1. 다섯 유리 병, 온도 제어 멀티 자석 교반기 위에 거기에 자기 교반 막대를 포함하는 각 놓습니다. A, B, C로이 병에 레이블을 각 약물, 즉 이부프로펜, 와파린, 페니토인, 그리고 설파 닐 아미드에 대한 각각 거라고. 제어 순수한 HSA와 함께 한 레이블.
    2. 각 바이알에 HSA 200 μl를 추가합니다. 네 대응하는 유리 병에 약액의 1 μl를 추가합니다. 컨트롤에 DMSO의 1 μl를 추가합니다. 교반기 전환하고 360 회전 속도를 설정RPM 및 HSA에 결합하는 약물을 완료 할 수 있도록 1 시간 동안 품어.
    3. 1 시간 후, 밀리 Q 물 200 μL와 일정한 교반하면서 각각의 유리 병에 금 (III) 클로라이드 용액 200 μl를 추가합니다. 10 분 동안 일정하게 교반하면서 60 ℃로 온도를 설정합니다. 각 바이알에 1.5 M NaOH를 20 μl를 첨가하고 0 분으로 반응 시간을 기록하기 시작한다.
    4. 신속하게 방출 스펙트럼을 (결과는 0 분으로 표시) 384 웰 블랙 플레이트에 각 바이알에서 용액 50 μL를 그리고 측정한다. 각 샘플마다 10 분의 발광 스펙트럼을 녹음. 네 개의 다른 시간에 적어도 네 개의 스펙트럼을 수집, 즉, 0, 10, 20, 및 30 분이다.
    5. 일관된 추세에 결과를 얻기 위해 3.1.4 여러 번 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. 자석 교반기를 중지합니다.
    6. (- D 및 제어) 각 샘플에 대한 시간 - 분해 광전자 스펙트럼 플롯. 다이에서의 Au 나노 결정의 형성 반응 속도를 비교하는 시간에 대한 모든 샘플 플롯의 피크 강도를 파악fferent 약물로드 단백질 템플릿.
  2. HSA에 특정 약물의 결합 상수를 측정
    1. 3.1.4 - 반복 3.1.1 단계를 반복합니다. (단 약물 로딩없이 HSA를 사용하여 제어 샘플 포함) 네 가지 농도에서 이부프로펜 솔루션 약물 솔루션을 교체합니다. 대응 약물 농도에 따른 유리 바이알에 라벨.
    2. 10 분 후, 싱크대에서 흐르는 물에 유리 튜브를 냉각. 주의 : 유리 병이 뜨겁습니다. 연소를 방지하기 위해 내열 장갑을 착용 할 것.
    3. 384 웰 검은 접시에 각각의 유리 병에서 위의 솔루션의 50 μL를 그리고, 발광 스펙트럼을 측정한다.
    4. 다른 약물 농도 결과의 또 다른 두 세트를 얻기 위해 3.2.3 두 번 더 - 반복 3.2.1 단계를 반복합니다.
    5. 자석 교반기를 중지합니다. 광전자 스펙트럼을 플롯 한 결과를 분석한다.
      1. 각각의 배치에서 얻어진 미가공 데이터를 위해, 각각의 광전자 스펙트럼 플롯소프트웨어 샘플 등 OriginPro의 소프트웨어와 같은 피크 강도를 찾을 수 있습니다.
      2. 상대 형광 강도 계산 및 플롯 [(I 0 - I)을 / I 0] 나는 내가 각각 약물로드 HSA 순수한 HSA에 형성된 금 나노 결정의 형광 강도를 참조 0 약물 농도에 대하여.
      3. 미카엘리스 - 멘텐 방정식을 사용하여 단일 부위 결합 모델에 데이터를 피팅함으로써 결합 상수를 계산한다 : R 최대가 최대 응답 신호가 나타내는 C / (K D + C) × Y = R 최대를, C는 리간드의 농도이고 D 및 K는 결합 상수이다. 이러한 OriginPro의 같은 소프트웨어에서이 작업을 수행합니다. 비선형 커브 피팅 피팅 메뉴 분석을 선택한 다음, 성장 / S 자형 범주에서 힐 기능을 선택합니다. 설정에서 : 기능 선택 페이지에서 장착 결과를 표시하는 맞춤을 클릭합니다.

결과

단백질의 반응성 작용기 (예를 들어, 티로신 잔기)가 캡슐화 된 금 이온을 감소시키고 이에 따라 금 나노 결정의 형성 비율을 가속 노출 될 수 있기 때문에, 전개 된 단백질들은 단백질 주형의 Au 나노 결정의 형성에 중요한 절차이다. 가열 및 외부 변성제는 단백질 전개 과정을 촉진하기 위해 두 가지 일반적인 방법이다. (1)는 모델 단백질로서 HSA를 사용하여, 금 나노 결정의 형?...

토론

이 방법으로 강조 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 다른 작은 분자 약물의 상대적 결합 친 화성을 심사의 프로토콜이 단계에서 3.1.2, 3.1.3 및 3.1.4은 상대 바인딩 강도 일관된 추세를 보여주는 좋은 결과를 얻을 중요하다. 이 단계에서, 측정 용 반응 액을 화학 물질을 첨가하여 드로잉 작업은 시간 지연 효과 및 일관성을 보장하기 위해 실시한다 측정 반응 액을 화학 물질을 첨가 및 도면의 동일?...

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Gold (III) chloride solution, 30%Sigma-Aldrich484385Corrosive, irritant
Human serum albumin, 96%Sigma-AldrichA1887
Bovine Serum albumin, 96%Sigma-AldrichA2153
Ibuprofen, 98%Sigma-AldrichI4883 
warfarin, 98%Sigma-AldrichA2250
phenytoinSigma-AldrichPHR1139
sulphanilamide, 99%Sigma-AldrichS9251
dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
ureaSigma-AldrichU5128
Sodium hydroxideSigma-Aldrich221465
Magnetic stirrerIKART5
Microplate readerTecanInfinite M200
384-well plateCorning
5 mL air displacement pipetteEppendorf
1000 mL air displacement pipetteEppendorf
100 mL air displacement pipetteEppendorf
5000 mL Eppendorf tips
1000 mL Eppendorf tips
100 mL Eppendorf tips
1.5 mL micro tubeEppendorf
20 mL glass vial with screw cap
4 mL glass vial with screw cap

참고문헌

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