Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

Riepilogo

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduzione

cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con la colonna montante derivatizzazione (PCD) è un potente strumento che è utile a risolvere una serie di questioni nel laboratorio di analisi. Può essere usato per rilevare composti che sono altrimenti non rilevabili con la serie di rivelatori disponibili ^1,2, aumentare il segnale dell'analita bersaglio, che permette limiti inferiori di rivelazione e quantificazione ^3-5 o selettivamente derivatize un analita bersaglio per evitare effetti di matrice ^6. Reazioni PCD comunemente usati includono la reazione di ammine, come aminoacidi, con orto-phthaladehyde ^7-9, ninidrina ^9,10 o fluorescamina ^11,12, la derivatizzazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) con il 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicali (DPPH ^{•) 13,14} o 2,2'-Azino-bis (acido 3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico (ABTS) ^15,16, e l'uso del reagente ioduro-azide per derivatize zolfo ccomposti ontaining ^17,18.

Vi sono, tuttavia, numerosi inconvenienti all'utilizzo di reazioni PCD con sistemi HPLC ^6. Principalmente fra questi è l'uso di bobine di reazione tra il punto di aggiunta del reagente di derivatizzazione (s) e il rilevatore, che consentono il tempo per la miscelazione e la reazione avvenga ^8. Questi reazione loop spesso hanno volumi di 500 ml o più, che è significativo rispetto al volume del resto del sistema HPLC ^19. L'uso di questi reazione alto volume passanti comporta un'accresciuta allargamento di picco rispetto a quello che sarebbe osservata senza la presenza del ciclo di reazione. Ciò si traduce in brevi picchi più ampi che hanno limiti superiori di quantificazione e rilevazione e negativamente effetti risoluzione cromatografica. Figure 1 e 2 evidenziare il deterioramento della forma del picco che risultano dalla somma dei vari postale colonna volumi ciclo di reazione. Questa analisiè stata eseguita con un cellulare composizione di fase di 94% metanolo e 6% di acqua Milli-Q. La portata della fase mobile era 1 ml / min, il volume di iniezione era di 20 microlitri e la lunghezza d'onda di analisi era 265 nm. Bobine di varia volumi morti da 20 ml a 1000 ml sono stati inseriti fra la colonna ed il rivelatore per simulare gli effetti di ciclo reazione volume morto nei metodi PCD. Questi cicli sono stati preparati da tubi di acciaio inossidabile di diametro interno 0,5 mm. L'esperimento è stato eseguito su un sistema HPLC costituito da un controllore (SCL-10AVP), una bassa pressione gradiente valvola (FCL-10ALVP), una pompa (LC-20AD), un iniettore (SIL-10ADVP), ed un rivelatore PDA ( SPD-M10ADVP). La fase mobile è stata pompata attraverso un sistema di degasaggio prima dell'introduzione nel sistema HPLC. La separazione è stata effettuata utilizzando un x 4.6 mm di diametro 5 micron colonna di 250 mm. Le condizioni sperimentali sono stati scelti per essere tipico delle reazioni PCD che sono stati recentemente pubblicati in letteratura.

Ilsemplice, più comune alberino configurazione reattore a colonna è definito un reattore tubolare non segmentato che è effettivamente un tubo lungo e sottile attraverso il quale il liquido può fluire e la reazione può avvenire. In questo picco sistema allargamento dipende non solo il volume morto aggiunto al sistema, ma anche il diametro interno del tubo, come evidenziato da Iijima et al. ^8. Inoltre, la geometria della bobina gioca un ruolo nella ampliamento marchio osservato. Stewart ²⁰ affermato che l'avvolgimento del reattore cambia i profili di flusso secondario, con conseguente migliore miscelazione, il che significa che il volume morto può essere minimizzato. E 'stato affermato che il picco allargamento non è significativo se si utilizza un tubolare aperto maglia della bobina ^21. Quando l'allargamento picco è troppo grande, altri tipi di reattore possono essere considerati ^20,22. Questi possono includere reattori a letto o reattori flusso segmentati. Questi reattori sono particolarmente utili per le reazioni lente che altrimenti require grande reazione loop. Come non segmentati reattori tubolari sono i tipi più comuni di reattori utilizzati in applicazioni PCD, il resto di questa voce con questo tipo di configurazione del reattore.

Il disegno della colonna flusso di reazione (RF) comprende un raccordo terminale multi-porta che permette fase mobile per uscire (o entrare) della colonna attraverso un singolo porto situato nella zona centrale radiale della colonna o tre porte situata al esterno regione di parete della colonna (vedi Figura 3). Questi due flussi sono separati usando un raccordo terminale contenente una fritta porosa centrale che è circondato da un anello impermeabile che è a sua volta circondato da un setto poroso esterna che si estende verso la parete della colonna. A causa del flusso anello trasversale impermeabile centrale non è possibile tra le due zone porose.

Durante reazione cromatografia flusso, il reagente di derivatizzazione (s) vengono pompati contro la direzione del flusso della fase mobile in uno o two delle porte esterne della colonna flusso di reazione. L'eluente colonna viene miscelato con il reagente di derivatizzazione (s) in fritta esterno e passa al rivelatore tramite una porta esterna libera. flusso di reazione può essere utilizzato sia per una derivatizzazione reattivo unico (1 porta per il reagente derivatizzazione, 1 porta per passare l'eluente della colonna al rivelatore e 1 porta bloccata) oppure un sistema di reagente doppio (2 porte per i reagenti di derivatizzazione e 1 porta ad passare l'eluente della colonna al rivelatore). Il flusso dal flusso centrale può essere utilizzato sia per rilevare eluente colonna underivatized, efficace rilevamento multiplexing ^23, o passato sprecato.

Un importante tecnica sintonizzazione che è disponibile quando si esegue RF-PCD cromatografia è il rapporto tra i flussi centrali e periferici. Il rapporto ottimale per ogni derivatizzazione dipende da una serie di fattori come se il flusso centrale sarà rilevato o passato a perdere. Pertanto una volta che il rapporto ottimale è stato determinato, Occorre garantire che il rapporto corretto flusso è ottenuta prima di essere eseguita ogni corsa.

Si è trovato che l'uso di una fritta di mescolare il flusso della colonna eluente ed il reagente derivatizzazione in RF-PCD risultati in miscelazione più efficiente rispetto alle tecniche di miscelazione tradizionali che impiegano tipicamente un raccordo a T di zero volume morto o volume morto partire W- pezzo per mescolare i due flussi. Ciò ha permesso l'uso di relativamente piccoli cicli di reazione, o addirittura l'eliminazione del ciclo di reazione del tutto. La riduzione dei risultati di reazione formato loop in picchi più rispetto ai metodi tradizionali di derivatizzazione post-colonna. Ciò significa che, nonostante il fatto che non tutti dell'eluente colonna viene derivatizzato, maggiore rapporto segnale rumore sono osservati e limiti quindi minori di rivelazione e quantificazione può essere raggiunto.

cromatografia flusso di reazione è stata sviluppata per superare le difficoltà con l'adattamento reazione PCDs alle moderne colonne HPLC e sistemi, in particolare la perdita di efficienza causata da banda ampliando causa di grande colonna montante volumi morti dovuti alla necessità di impiegare grandi volumi di reazione loop. I processi di miscelazione più efficienti in RF-PCD rispetto al PCD convenzionale significa che i volumi del ciclo di reazione più piccoli possono essere impiegati portando ad un aumento di efficienza di separazione osservata. Inoltre RF-PCD cromatografia mostra sia il segnale aumentata e diminuita rumore rispetto alle tecniche convenzionali PCD con conseguente limiti inferiori di rilevazione e quantificazione rispetto ai metodi convenzionali PCD. Un ulteriore vantaggio di RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali PCD è la capacità di monitorare il flusso underivatized che eluisce dalla porta centrale della colonna RF nonché il flusso derivatizzato che eluisce dalla regione periferica della colonna. RF-PCD è una relativamente nuova, ma promettente tecnica che consente di visualizzare molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali PCD.

Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC.

Protocollo

Attenzione: Si prega di fare riferimento alle schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell'uso (ad esempio, scheda di sicurezza per il metanolo). Garantire l'uso di tutte le pratiche di sicurezza appropriate durante la manipolazione di solventi e ad alte prestazioni cromatografia liquida eluente (HPLC). Garantire un uso appropriato di controlli tecnici di HPLC, analitica equilibrio e rilevatore di strumentazione, e garantire l'uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, e scarpe chiuse).

Nota: Questo protocollo descrive 3 modi di flusso di reazione derivatizzazione post-colonna (RF-PCD) tecniche, ciascuna con un reagente diverso specifico per la natura di un composto chimico di interesse. Per l'analisi del ROS vai alla sezione "1. Rilevamento di ROS utilizzando DPPH ^•", per l'analisi delle ammine primarie vedere la sezione "2. Individuazione di ammine primarie con fluorescamina", e per l'analisi dei composti fenolici andare alla sezione "3 . rilevamento di fenoliusando 4 aminoantipyrene e ferricianuro di potassio ". Utilizzare acqua ultra-pura (ad esempio, acqua Milli-Q) in tutto.

Nota: Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC.

1. Rilevamento di ROS Utilizzando DPPH ^•

1. Messa a punto di strumenti HPLC
   1. Preparazione dello strumento HPLC con 100% di acqua sulla linea A e 100% metanolo sulla linea B come fase mobile. Eliminare le pompe secondo i requisiti del produttore.
   2. Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A.
   3. Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d'onda di 520 nm.
2. Messa a punto dicolonna RF
   1. Collegare l'ingresso della colonna RF allo strumento HPLC.
   2. Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF.
   3. Collegare un porto periferico di uscita al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubi id.
   4. Collegare il DPPH ^• linea di pompa ad una porta periferica sull'uscita della colonna RF.
   5. Bloccare la porta periferica inutilizzata sull'uscita della colonna RF con un tappo di colonna.
   6. Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% linea B - 100% metanolo.
   7. Equilibrare la colonna con la fase mobile metanolo 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo deve essere scalata in base alle dimensioni delle altre colonne l'utente può impiegare.
3. Preparazione del DPPH ^• reagente
   1. Preparare una soluzione / ml 0,1 mg di DPPH ^• in metanolo.
   2. Sonicare il pallone contenente il DPPH ^• reagente per 10 min.
   3. Coprire il pallone in foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
   4. Spurgare la pompa DPPH ^• con il preparato DPPH ^• reagente secondo i requisiti del produttore.
4. Mettere a punto il uscita della colonna RF
   1. Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l'altro come periferica.
   2. Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min.
   3. Pesare nuovamente la nave porto centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue:
      Peso di Port centrale (g) = peso finale di Port Central Vessel (g) - peso iniziale di Port Central Vessel (g)
   4. Ripetere i punti 1.4.2 e 1.4.3 per l'effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per la nave porta periferica comesegue:
      Peso di porta periferica (g) = peso finale della porta periferica Vessel (g) - peso iniziale della porta periferica Vessel (g)
   5. Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue:
      % Port Centrale = Peso di Port centrale (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100
      % Porta periferica = Peso della porta periferica (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100
   6. Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 30:70 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore a 30%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all'uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è inferiore al 30% diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale.
   7. Ripetere il passaggio da 1.4.1 a 1.4.6 fino a un rapporto di segmentazione di 30:70 (centrale: periferica) è raggiunto.
   8. Impostare la portata del DPPH ^• Pompa reagente per 0,5 ml min ^-1.
      Nota: La colonna RF impostato con DPPH ^• reagente è ora pronto per l'analisi. I campioni possono ora essere iniettati.
5. Posta eseguire condizioni di arresto
   1. Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, fermare il flusso pompa derivatizzazione reagente.
   2. Rimuovere il DPPH ^• linea di pompa del reagente dalla porta periferiche e si chiude il porto.
   3. Equilibrare la colonna con la fase mobile in cui deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min ^-1 per 10 min.
   4. Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC.
   5. Sostituire il DPPH ^• reagente con metanolo e spurgare la pompa aggiuntiva.
      Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto.

2. Rilevamento di ammine primarie Uso flammina

1. Preparazione della fase mobile
   1. Preparare 1 L di una soluzione di acetato di ammonio 10 mM, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume.
   2. Aggiungere 52,6 ml di acetonitrile (ACN) al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95:05 (buffer: ACN).
2. Messa a punto di strumenti HPLC
   1. Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa secondo i requisiti del produttore.
   2. Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A.
   3. Fissare una bobina attenuatore di pulsazioni alla pompa derivatizzazione.
   4. Set-up rivelatore di fluorescenza (FLD) con lunghezza d'onda di eccitazione di 390 nm ed emissione lunghezza d'onda di 475 nm.
3. Messa a punto di colonna RF
   1. Collegare °e all'ingresso della colonna RF allo strumento HPLC.
   2. Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF.
   3. Collegare un porta periferica all'uscita della colonna RF al rivelatore FLD usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id.
   4. Collegare la linea pompa derivatizzazione ad una porta periferica sull'uscita della colonna RF.
   5. Bloccare la porta periferica inutilizzata sull'uscita della colonna RF con un tappo di colonna.
   6. Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% linea A - 10 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% ACN.
   7. Equilibrare la colonna con la linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l'utente può impiegare.
4. Preparazione del reagente fluorescamina
   1. Rendere 100 ml di 0,1 mg ml ^-1 fluorescamina reagente.
   2. ultrasuoni per 1 min.
   3. Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.
   4. Spurgare la pompa del reagente con il reagente fluorescamina preparato secondo i requisiti del produttore.
5. Mettere a punto il uscita della colonna RF
   1. Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l'altro come periferica.
   2. Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min.
   3. Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3.
   4. Ripetere i punti 2.5.2 a 2.5.3 per l'effluente uscire dal FLD che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4.
   5. Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5.
   6. Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e perifericaflusso è 43:57 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è sopra 43%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all'uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è sotto 43%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale.
   7. Ripetere il passaggio 2.5.1 a 2.5.6 fino a un rapporto di segmentazione di 43:57 (centrale: periferica) è raggiunto.
   8. Impostare la portata della pompa fase mobile a 0,7 ml min ^-1.
   9. Impostare la pompa derivatizzazione a scorrere a 0,1 ml min ^-1.
      Nota: La colonna RF impostato con il reagente fluorescamina è ora pronto per l'analisi. I campioni possono ora essere iniettati.
6. Posta eseguire condizioni di arresto
   1. Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, arrestare la pompa derivatizzazione.
   2. Rimuovere la riga pompa derivatizzazione dalla porta periferiche e tappo.
   3. Equilibrare la colonna con la fase mobile inquale deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min ^-1 per 10 min.
   4. Arrestare il flusso della pompa fase mobile.
   5. Sostituire il reagente fluorescamina con acetonitrile e spurgare la pompa derivatizzazione.
      Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto.

3. Rilevamento di fenoli con 4-Aminoantipyrene e Potassio ferricianuro

1. Preparazione della fase mobile
   1. Preparare 1 L di una soluzione di 100 mM di acetato di ammonio, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume.
   2. Aggiungere 52,6 ml di metanolo al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95: 5 (buffer: metanolo).
2. Messa a punto di strumenti HPLC
   1. Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa come da produttore '; S requisiti.
   2. Impostare i componenti strumentali HPLC e le due pompe reagenti supplementari come illustrato in Figura 4B.
   3. Attaccare una bobina attenuatore di pulsazioni a ciascuna delle pompe reagenti.
   4. Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d'onda di 500 nm.
3. Messa a punto di colonna RF
   1. Collegare l'ingresso della colonna RF allo strumento HPLC.
   2. Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF.
   3. Collegare un porta periferica all'uscita della colonna RF al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id.
   4. Collegare ciascun reagente (cioè, 4-aminoantipyrene e ferricianuro di potassio) linea di pompe a una porta periferica sull'uscita della colonna RF.
   5. Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min ^-1 a 100% linea A - 100 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% di metanolo.
   6. Equilibrare la colonna wesima linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l'utente può impiegare.
4. Preparazione del reagente 4 aminoantipyrene
   1. Preparare un tampone di acetato di ammonio con un pH di 9, seguendo passo 3.1.1.
   2. Pesare 150 mg 4 aminoantipyrene e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio preparati (pH 9).
   3. Con ultrasuoni per 1 min.
   4. Coprire con un foglio per evitare l'esposizione alla luce.
   5. Eliminare la prima pompa reagente con il preparato Reattivo 4 aminoantipyrene secondo i requisiti del produttore.
5. Preparazione di potassio reagente ferricianuro
   1. Pesare 150 mg di ferricianuro di potassio e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio (pH 9) preparati secondo passo 3.1.1.
   2. Con ultrasuoni per 1 min.
   3. Copertura in foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
   4. Purge la seconda pompa reagente con il preparato reagente ferricianuro di potassio secondo i requisiti del produttore.
6. Messa a punto di colonna RF
   1. Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l'altro come periferica.
   2. Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min.
   3. Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3.
   4. Ripetere i punti da 3.6.2 a 3.6.3 per l'effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4.
   5. Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5.
   6. Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 50:50 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore al 50%, diminuire laquantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id al porto centrale di uscita. Se il flusso centrale è inferiore al 50%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale.
   7. Ripetere il passaggio 3.6.1 a 3.6.6 fino a un rapporto di segmentazione di 50:50 (centrale: periferica) è raggiunto.
   8. Impostare la portata della pompa 4 aminoantipyrene a 0,5 ml min ^-1.
   9. Impostare la portata della pompa ferricianuro di potassio 0,25 ml min ^-1.
      Nota: La colonna RF istituito con i reagenti bicomponenti è ora pronto per l'analisi. I campioni possono ora essere iniettati.
7. Posta eseguire condizioni di arresto
   1. Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati corsa è terminata, indicando che la corsa è terminata, fermare entrambe le pompe reagenti.
   2. Rimuovere le linee della pompa del reagente dalle porte periferiche e sostituirli con un 15 centimetri pezzo di tubo 0,13 millimetri.
   3. Equilibrare la colonna con la fase mobile in WHIch esso deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min ^-1 per 10 min.
   4. Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC.
   5. Sostituire entrambi i reagenti sul reagente pompe con metanolo ed eliminare le pompe supplementari secondo il requisito del produttore.
      Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto.

Risultati

Il primo metodo PCD che è stato adattato per l'utilizzo da RF-PCD era la derivatizzazione di antiossidanti utilizzando la 2,2-difenil-1-picrylhydrazil radicale (DPPH ^{•) 24.} Questa reazione è stato introdotto da Koleva et al. ²⁵ ed è stato ampiamente utilizzato fin. Il rilevamento si basa sulla decolorazione del DPPH ^• radicalico in presenza di specie reattive dell'ossigeno, quindi, la presenza di antiossidanti risultati in una goccia assorbanza osservat...

Discussione

RF-PCD consente la miscelazione efficiente del reagente derivatizzazione con l'effluente post-colonna HPLC senza l'uso di bobine di reazione, minimizzando gli effetti di banda allargamento e migliorando le prestazioni di separazione. Metodi RF-PCD hanno anche mostrato miglioramenti nella risposta del segnale rispetto al metodo di rilevazione. Camenzuli et al. ²⁸ è stato il primo a segnalare l'uso di colonne di flusso di reazione con DPPH ^• per la rilevazione di ROS in un cam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30