Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Riepilogo

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell'età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.

Abstract

Difetti di nascita che coinvolgono la corteccia cerebrale — conosciuto anche come malformazioni dello sviluppo corticale (MCD) — sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% dell'epilessia resistente alla droga nell'infanzia. Formazione immagine del cervello ad alta risoluzione ha facilitato l'identificazione in vivo di un grande gruppo di fenotipi MCD. Nonostante gli avanzamenti nella formazione immagine del cervello, analisi genomica e generazione di modelli animali, un semplice flusso di lavoro sistematicamente la priorità geni candidati e per testare gli effetti funzionali delle mutazioni putative è manca. Per ovviare a questo problema, una strategia sperimentale che consentano l'identificazione di nuovi geni causativi per MCD è stata sviluppata e validata. Questa strategia si basa sulla identificazione candidato regioni genomiche o geni mediante array-CGH o intero-dell'esoma sequenziamento e caratterizzare gli effetti della loro inattivazione o della sovraespressione di mutazioni specifiche nel roditore cervelli via in utero di sviluppo elettroporazione. Questo approccio ha portato all'identificazione del gene C6orf70 , che codifica per una proteina vescicolare, alla patogenesi di eterotopia nodulare periventricolare, un MCD causati da difetti di migrazione neuronali.

Introduzione

La corteccia cerebrale svolge un ruolo chiave nei processi cognitivi e intellettuali ed è coinvolta nella memoria come apprendimento e controllo emotivo. Pertanto, non è sorprendente che molte malattie neurologiche e psichiatriche derivano da malformazioni dello sviluppo corticale (MCD). L'eziologia di MCD è complesso poiché entrambi acquisito e fattori genetici sono coinvolti. La prevalenza cumulativa di geneticamente determinata proporzione di MCD è circa il 2% e sono nella maggior parte dei casi sporadici. Per esempio, l'incidenza di disgenesia cerebrale congenita è stata stimata per essere superiore all'1% nella popolazione umana, e alcune forme di MCD sono osservate in più del 14% di tutti i pazienti con epilessia e nel 40% di epilessia intrattabile o grave^{1, 2}.

Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è uno della più comuni MCDs ed è causata da anomalie della migrazione dei neuroni dalla zona ventricolare (VZ) alla corteccia cerebrale in via di sviluppo. Il fallimento dei neuroni per migrare i risultati in gruppi di neuroni heterotopic lungo le pareti dei ventricoli laterali che di solito possono essere visualizzati usando la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI). Le caratteristiche cliniche, anatomiche e imaging dell'EPN sono eterogenee. I noduli possono variare da piccole e unilaterale bilaterale e simmetrica. Conseguenze cliniche comuni includono l'epilessia e intellettuale disabilità³. Le mutazioni nel gene Della filamina A (o FLNA), che associa in Xq28, sono state trovate nel 100% delle famiglie con EPN bilaterale X-collegato e nel 26% dei pazienti sporadici^3,4. Una rara forma recessiva di PNH causata da mutazioni nel gene ARFGEF2 , che associa in 20q13, è stata segnalata in due famiglie consanguinee⁵. Recentemente, sono state identificate mutazioni bialleliche nei geni che codificano la coppia di cadherin recettore-ligando DCHS1 e FAT4 in nove pazienti affetti da un disordine multisystemic che include PNH⁶. PNH inoltre è stato associato con X fragile sindrome⁷, sindrome di Williams⁸, di sindrome da microdelezione 22q11⁹, duplicazioni 5p15¹⁰, eliminazioni in 1 p 36¹¹, 5q14.3-q15¹², 6p25¹³ e 6q omissione terminale sindrome^{14,15,16,17,18,19}, suggerendo che altri geni causativi sono sparsi in tutto il genoma. Tuttavia, per circa il 74% dei pazienti sporadici di PNH la base genetica rimane per essere delucidato¹⁷.

Mappatura genica classica si avvicina come matrice l'ibridazione Genomic comparativa (array-CGH) hanno dimostrato di essere un potenti strumenti per la rilevazione di anomalie cromosomiche submicroscopica, tuttavia, le regioni genomiche identificate utilizzando questo approccio sono spesso grandi e contengono numerosi geni.

L'avvento delle tecniche di sequenziamento massivo parallelo (cioè intero-esoma sequenziamento (WES) e Whole-Genome sequencing (WGS)) ha sostanzialmente ridotto sia il costo e il tempo necessario per un'intera dell'esoma umano o del genoma di sequenza. Tuttavia, l'interpretazione dei dati di WES e WGS rimane impegnativo nella maggioranza dei casi, poiché per varianti di ogni paziente decine di centinaia (o migliaia, a seconda del tipo di analisi) emergono dal filtraggio dei dati.

Per accelerare il processo di identificare nuovi geni causativi di MCD, una strategia sistematica romanzo combinando array-CGH, WES e nell'utero elettroporazione (IUE) screening di geni candidati è stato progettato. IUE permette di inattivare selettivamente (o dei overexpress) specifici geni o mutazioni nei cervelli del roditore, consentendo la rapida valutazione del loro coinvolgimento in corticogenesis^18,19. RNAi mediata-atterramento o sovraespressione di uno o più geni candidati dovrebbe causare, quando il gene è associato con lo sviluppo della malattia, difetti localizzati nella migrazione neuronale e/o maturazione. Al momento l'identificazione di un gene di cui inattivazione (o sovraespressione) riproduce il fenotipo osservato nei pazienti in roditori, diventa un candidato eccezionale per lo screening in pazienti sporadici con MCD. Utilizzando questo approccio, abbiamo recentemente rivelato il contributo cruciale del gene C6orf70 (noto anche come ERMARD) nella patogenesi dell'EPN in pazienti che harbouring 6q27 delezioni cromosomiche¹⁶.

Protocollo

Dichiarazione etica: Ratti Wistar erano accoppiati, mantenuti e utilizzati nelle strutture animale INMED, in accordo con la legislazione dell'Unione europea e francese.

1. DNA estrazione e quantificazione per Array-CGH e WES

1. Estrarre il DNA genomico (gDNA) dai leucociti del sangue umano da pazienti che usando un robot automatico di isolamento del DNA o disponibili in commercio kit di estrazione del DNA manuale secondo il protocollo del produttore. Quantificare tutti i campioni usando uno spettrofotometro.

2. protocollo array-CGH

1. Digestione di limitazione di gDNA
   1. Doppia digest 500 ng di gDNA purificato da un paziente e un controllo umano disponibile nel commercio del DNA con RsaI e AluI per 2 ore a 37 ° C. Utilizzare 0,5 μl di enzima U/μL 10 per ogni reazione. Incubare per 20 minuti a 65 ° C per inattivare gli enzimi e spostare le provette in ghiaccio.
2. Esempio di etichettatura
   1. Aggiungere il volume appropriato di Random Primers necessario per il formato di microarray in uso a ciascuna provetta di reazione (ad es. 5 µ l per i microarrays 1-pack, confezione da 2 e 4-pack). Miscelare bene pipettando su e giù delicatamente.
   2. Trasferire un termociclatore provette. Incubare a 95 ° C per 3 min e poi a 4 ° C per 5 min.
   3. Preparare un cianina cianina 3 e un 5 etichettatura Master Mix su ghiaccio mescolando i seguenti volumi: 10.0 µ l 5 X tampone di reazione, 5,0 µ l 10 x dNTPs, 3,0 µ l cianina 3-dUTP o cianina 5-dUTP e 1,0 µ l Exo (-) enzima Klenow, 2.0 µ l Nuclease-Free Water. Scegliere il volume di ciascun reagente in base al formato di microarray in uso.
   4. Aggiungere il Mix Master etichettatura a ciascuna provetta di reazione contenente il gDNA. Miscelare bene pipettando delicatamente su e giù.
   5. Trasferire un termociclatore provette e incubare a 37 ° C per 2 h, 65 ° C per 10 min e poi mantenere i campioni a 4 ° C.
3. Purificazione di gDNA etichettato
   1. Aggiungere 430 µ l di 1 x TE (pH 8.0) a ciascuna provetta di reazione.
   2. Inserire una colonna di purificazione in provette di raccolta da 2 mL ed etichettare correttamente le colonne. Ogni carico etichettati gDNA su una colonna di purificazione.
   3. Centrifugare per 10 min a 14.000 x g in una microcentrifuga a temperatura ambiente. Scartare il flusso continuo e posizionare la colonna indietro nel tubo di raccolta da 2 ml.
   4. Aggiungere 480 µ l di 1 x TE (pH 8.0) per ogni colonna. Centrifugare per 10 min a 14.000 x g in una microcentrifuga a temperatura ambiente. Scartare il flusso continuo.
   5. Invertire la colonna in un tubo di raccolta fresca 2 mL e centrifugare per 1 min a 1.000 x g in una microcentrifuga a temperatura ambiente per raccogliere il campione purificato.
   6. Portare il volume di campione a quello richiesto per il formato di microarray in uso utilizzando un concentratore o aggiungendo 1 x TE (pH 8.0). Ad esempio, per 1-pack microarray portare il volume a 80,5 µ l. Incubare il campione in ghiaccio per 5 minuti e quindi dispensare la soluzione su e giù per 10 volte.
4. Preparazione di gDNA etichettato per ibridazione
   1. Combinare i campioni di prova e di riferimento utilizzando la cianina appropriato 5-etichettato campione e la cianina 3-etichettato campione in una provetta di fresco da 1,5 mL RNAsi-libera. Ad esempio, per microarray pack 1 Assicurarsi che il volume finale è 158 µ l. scegliere il volume di ogni campione in base al formato di microarray in uso.
   2. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare il rendimento, grado di etichettatura o specifiche attività misurando l'assorbanza a A260 nm (DNA), A550 nm (cianina 3) e A650 nm (cianina 5).
      1. Calcola rendimento utilizzando la formula: [DNA concentration(ng/µl) x volume di campione (µ l)] / 1.000 (ng / µ g). Calcolare l'attività specifiche utilizzando la formula: pmol per µ l di colorante / µ g / µ l di gDNA.
         Nota: ad esempio, 0,5 µ g di DNA di input, il rendimento dovrebbe essere 8 a 11 µ g e l'attività specifica (pmol / µ g) dovrebbe essere 25 a 40 per la cianina-3 etichettato campione e da 20 a 35 per l'esempio etichettato cianina-5.
   3. Per preparare la quantità di ibridazione Master Mix necessario per il formato di microarray in uso, mescolare i seguenti reagenti: 50 µ l DNA Cot-1 (1,0 mg/ml), 52 µ l 10 x aCGH agente bloccante e 260 µ l 2 x HI-RPM tampone di ibridazione.
   4. Aggiungere il volume appropriato di ibridazione Master Mix alla provetta da 1,5 ml RNAsi-libera che contiene il gDNA etichettato per ottenere il volume totale richiesto per il formato di microarray in uso. Ad esempio, per 1 confezione microarray, assicurarsi che il volume finale per ogni reazione è µ l 362.
   5. Mescolare il campione pipettando su e giù, poi rapidamente Centrifugare a 14.000 x g e incubare per 3 min a 95 ° C e a 37 ° C per 30 min.
5. Assemblea di Chambers e ibridazione
   1. Caricare una diapositiva di guarnizione pulito nella camera base con l'etichetta di guarnizione rivolto verso l'alto e allineato con la sezione rettangolare della camera base. Assicurarsi che la diapositiva di guarnizione è a filo con la base di alloggiamento e non è socchiusa.
   2. Dispensare miscela campione ibridazione sul pozzo guarnizione, assicurandosi che il campione sia distribuito uniformemente.
   3. Mettere una diapositiva di microarray sulla diapositiva di guarnizione per valutare che la coppia di panino sia allineata correttamente. Quindi, montare la camera di reazione, mettere il coperchio sulle diapositive sandwich e il morsetto di serraggio manuale.
   4. Garantire vetrini bagnare ruotando la camera montata verticalmente. Assicurarsi che le bolle non sono presenti in aula. Se necessario, toccare il montaggio su una superficie dura per spostare bolle stazionarie.
   5. Mettere gli alloggiamenti di scivolo montato in un rack di rotatore istituito per ruotare a 20 giri/min. Mettere la camera di ibridazione in un forno ed effettuare l'ibridazione a 65 ° C per 24 o 40 h in base al formato di microarray in uso.
6. Lavaggio di microarray e scansione
   1. Prendere la camera di ibridazione fuori forno e immergerlo nel tampone di lavaggio 1. Procedere al suo smontaggio.
   2. Rimuovere il vetrino di microarray e rapidamente messo in un cestello per i vetrini in tampone di lavaggio 1 a temperatura ambiente.
   3. Lavare il vetrino di matrice per 5 minuti mescolando (utilizzare una pulce e un agitatore magnetico). Regolare la velocità dell'agitatore a un'impostazione di 4 (velocità media), per ottenere buoni ma non troppo vigorosa miscelazione.
   4. Lavare il vetrino di matrice nel tampone di lavaggio 2 per 90 agitazione di s. Recuperare delicatamente il vetrino dal buffer (dovrebbe emergere asciutto) e caricarlo in un portavetrini con l'ausilio di un protettore di diapositiva.
   5. Caricare la diapositiva nello scanner array ed eseguire la scansione in base alle istruzioni del produttore della matrice.
   6. Analizzare i risultati utilizzando il software di estrazione fornito con lo scanner in uso secondo le istruzioni del produttore (V.9.1.3.1).

3. WES protocollo

1. Arricchimento di destinazione
   1. Utilizzare il dsDNA BR analisi per determinare la concentrazione del campione gDNA secondo il protocollo di strumento.
   2. Diluire 5 µ g di alta qualità doppio filamento del DNA con 1x basso TE in un tubo di bind basso 1,5 mL in un volume totale di 50 µ l.
   3. Impostare un sonicatore e mettere una microprovetta nella stazione di carico e scarico secondo le istruzioni del fabbricante. Tenere il tappo sul tubo.
   4. Trasferire lentamente il 50 µ l di campione di DNA attraverso i setti pre-splii senza introdurre bolle.
   5. Taglio del DNA secondo le impostazioni suggerite dal produttore di sonicatore e valutare la qualità utilizzando un Bioanalyzer secondo le istruzioni del fabbricante. La dimensione del frammento di DNA di destinazione è 150-200 bp.
2. Riparazione del DNA si conclude
   1. Preparare la miscela di reazione di riparazione fine con 40 µ l di fine riparazione enzima Mix con 10 µ l di fine riparazione Oligo Mix. Mescolare bene su un Vortex.
   2. Incubare i campioni a 20 ° C per 30 min in un termociclatore e poi tenerli a 4 ° C. Non utilizzare un coperchio riscaldato.
   3. Aggiungere 50 µ l della miscela di reazione di riparazione fine preparata al punto 3.2.1 a ogni 50 µ l Tosato campione di DNA bene. Mescolare bene pipettando su e giù o delicato nel Vortex.
   4. Purificare il campione con un kit di purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
3. Poliadenilazione di 3' estremità.
   1. Aggiungere 20 µ l di Master Mix dA-Tailing per ciascun campione di DNA purificato, fine-riparato (circa 20 µ l).
   2. Mescolare bene pipettando su e giù o delicato nel Vortex.
   3. Incubare i campioni a 37 ° C in un termociclatore e poi tenerlo a 4 ° C. Non utilizzare un coperchio riscaldato.
4. Legatura della scheda indicizzazione di pre-acquisizione.
   1. Aggiungere 5 µ l di legatura Master Mix per ciascun campione di DNA A coda.
   2. Aggiungere 5 µ l della soluzione appropriata di indice pre-capture per ogni campione.
   3. Sigillare i pozzetti e mescolare nel Vortex per 5 s. brevemente Centrifugare i campioni.
   4. Incubare i campioni a 20 ° C per 15 min in un termociclatore e quindi tenere a 4 ° C. Non utilizzare un coperchio riscaldato.
   5. Purificare i campioni con un kit di purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
5. Amplificazione della raccolta indicizzata.
   1. Preparare il volume appropriato di miscela di reazione PCR pre-capture con 1 µ l di Primer Mix e 25 µ l di PCR Master Mix. Mescolare bene su un Vortex.
   2. Combinare 26 µ l di miscela di amplificazione in pozzetti separati di una piastra PCR e 24 µ l di ciascun campione di libreria gDNA indicizzata.
   3. Eseguire un programma PCR con le seguenti operazioni: 98 ° C per 2 min, 5 cicli a 98 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min. tenere i campioni a 4 ° C.
   4. Purificare il campione con un kit di purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
   5. Valutare la qualità con un Bioanalyzer secondo il protocollo del produttore.
6. Pool di campioni di DNA indicizzati per ibridazione
   1. Per ogni pool di reazione di cattura, combinare il volume appropriato di ciascun campione di libreria gDNA indicizzata in un pozzetto di una piastra PCR. Ad esempio, per umani o Mouse All-Exon Capture librerie, combinare 8 librerie per ogni pool utilizzando 187.5 ng di ogni raccolta indicizzata. Garantire che ogni pool di reazione di cattura finale contiene 1.500 ng di gDNA indicizzata.
   2. Ridurre il volume in ogni bene a < 7 µ l utilizzando un concentratore a vuoto. Evitare l'essiccazione completamente il campione.
   3. Aggiungere sufficiente acqua priva di nucleasi a ogni pool gDNA concentrato per portare il volume finale di ben 7 µ l e poi vortice la piastra che contiene gDNA vigorosamente per 30 s. centrifuga in una casella di selezione centrifuga o mini-piatto per raccogliere il liquido sul fondo dei pozzetti.
7. Ibridazione delle piscine biblioteca gDNA alla libreria di catturare
   1. Ogni pool di gDNA 7 µ l indicizzati, aggiungere 9 µ l di Mix di blocco. Pipettare su e giù per mescolare.
   2. I pozzi di Cap, trasferire la piastra sigillata contenente gDNA a termociclatore e incubare a 95 ° C per 5 min, quindi tenerlo a 65 ° C. Accertare che la piastra è fissata a 65 ° C per almeno 5 min.
   3. Preparare la diluizione appropriata di RNAsi blocco, sulla base delle dimensioni della libreria di cattura (10% diluizione per librerie < 3.0 Mb e 25% diluizione per librerie > 3,0 Mb).
   4. Secondo il formato di libreria Capture, combinare la quantità adeguata di Capture Library e diluire la soluzione di RNAsi blocco in un piatto PCR tenuto su ghiaccio. Mescolare bene il pipettaggio. Per le librerie cattura < 3,0 Mb, uso 2 µ l di biblioteca e 5 µ l di RNAsi blocco a 10% diluizione. Per le librerie di cattura > 3,0 Mb, uso 5 µ l di biblioteca e 2 µ l di RNAsi blocco a 25% diluizione.
   5. Aggiungere 37 µ l di tampone di ibridazione ad ogni pozzetto contenente 7 µ l di mix di catturare biblioteca/RNasi blocco. Miscelare bene pipettando e centrifugare brevemente la piastra che contiene il mix.
   6. Mantenere la piastra di piscina gDNA a 65 ° C durante l'utilizzo di una pipetta multicanale per trasferire l'intero 44 µ l di miscela Capture Library dal passaggio 3.7.5 a ciascun campione bene della piastra piscina gDNA. Miscelare bene pipettando lentamente su e giù per 8 a 10 volte.
   7. Sigillare i pozzetti con tappi di striscia a cupola. Assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente sigillati. Mettere un tappetino di compressione sopra il piatto PCR nel termociclatore.
   8. Incubare la miscela di ibridazione per 24 h a 65 ° C. Nota: Esempi possono essere ibridate per fino a 72 h, ma devono verificare che l'ibridazione estesa non causa evaporazione esteso in pozzetti.
8. Preparazione di biglie magnetiche rivestite con streptavidina
   1. Preriscaldare il tampone di lavaggio 2 a 65 ° C in un blocco di calore o vasca di acqua.
   2. Risospendere vigorosamente la streptavidina biglie magnetiche su un Vortex. I branelli magnetici stabilirsi durante la conservazione.
   3. Per ogni campione di ibridazione, aggiungere 50 µ l di sedimento perline pozzetti di una piastra PCR.
   4. Lavare le perle e li risospendere in 200 µ l di Binding Buffer.
9. Cattura del DNA ibridato utilizzando streptavidina perline.
   1. Stimare e registrare il volume di soluzione di ibridazione che rimane dopo la 24 ore di incubazione.
   2. Mantenere la piastra di ibridazione a 65 ° C e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire l'intero volume (circa 60 µ l) di ogni miscela di ibridazione per i pozzetti della piastra contenente 200 µ l di streptavidina lavato perline. Miscelare bene pipettando lentamente su e giù per 3 a 5 volte.
   3. Tappare i pozzetti e incubare la piastra cattura un Nutator mixer o equivalente per 30 min a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni sono correttamente miscelazione nei pozzetti.
   4. Centrifugare brevemente la piastra di bloccaggio in una casella di selezione centrifuga o mini-piastra.
   5. Mettere la piastra di cattura in un separatore magnetico per raccogliere le perle dalla sospensione. Rimuovere e scartare il surnatante.
   6. Risospendere le sfere in 200 µ l di tampone di lavaggio 1. Mescolare pipettando su e giù fino a quando le perline sono risospese completamente.
   7. Centrifugare brevemente in una casella di selezione centrifuga o mini-piastra.
   8. Mettere la piastra nel separatore magnetico.
   9. Attendere che la soluzione cancellare, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
10. Esempio di elaborazione per il sequenziamento multiplex di post-acquisizione
    1. Preparare il volume appropriato di miscela di reazione PCR mescolando i seguenti: 9 µ l Nuclease-free acqua, 25 µ l Master Mix e 1 µ l Primer Mix secondo il numero di amplificazioni. Mescolare bene usando un miscelatore vortex e mantenere il ghiaccio.
    2. Per ogni reazione di amplificazione, posto 35 µ l della miscela di reazione PCR dal punto 3.10.1 nei pozzetti di una piastra PCR.
    3. Ogni pipetta dei campioni pool associato a tallone catturati biblioteca su e giù per assicurare che la sospensione della perla è omogenea.
    4. Aggiungere 15 µ l di ogni sospensione di perlina piscina biblioteca catturati alla miscela di reazione PCR appropriata. Mescolare accuratamente pipettando fino a quando la sospensione della perla è omogenea.
    5. Posizionare la piastra preparata al punto 3.10.2 in un termociclatore ed eseguire il seguente programma di amplificazione di PCR: 98 ° C per 2 min, 8 a 11 cicli a 98 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, seguito da un'estensione finale a 72 ° C per 10 min. Tenere i campioni a 4 ° C.
    6. Purificare il campione con una purificazione di perline basati secondo il protocollo del produttore.
    7. Valutare la qualità con un Bioanalyzer secondo il protocollo del produttore.
11. Preparazione di campioni per multiplex sequenziamento
    Nota: Gli ultimi campioni arricchiti contengono piscine di 8 o 16 librerie indicizzate, sulla base delle dimensioni di Capture Library e conseguente pre-capture pool di strategia. Il numero totale di indicizzata librerie che possono essere multiplexati in una corsia singola sequenza è determinato dalle specifiche uscita della piattaforma utilizzata, insieme con la quantità di dati di sequenziamento necessari per la libreria di catturare.
    1. Calcolare il numero di indici che possono essere combinati per corsia, secondo la capacità della piattaforma. Il numero totale di indicizzata librerie che possono essere multiplexati in una corsia singola sequenza è determinato dalle specifiche uscita della piattaforma utilizzata, insieme con la quantità di dati di sequenziamento necessari per la libreria di catturare. Ad esempio, per la libreria di v5 essone tutti gli umani, i dati di sequenziamento consigliato per raccolta indicizzata è di 4 Gb e i dati di sequenziamento consigliato per piscina pre-capture è 32 Gb (8-Indice piscine).
12. Sequenza le librerie.
    1. Caricare le librerie sulla piattaforma di sequenziamento di nuova generazione di scelta ed eseguire il sequenziamento eseguito secondo le specifiche dello strumento.
13. Analizzare dati di sequenziamento dell'esoma.
    1. Eseguire la pipeline e il software di scelta per la chiamata base. Ad esempio, è possibile utilizzare Denny mappare letture²⁰, rimuovere i duplicati con Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) e identificare i polimorfismi a singolo nucleotide e inserimento o l'eliminazione delle basi (indels) con Platypus²¹. Filtrare sinonimi varianti e quelli osservati con una frequenza allele < 5% e confrontare i dati con quelli da exomes parentale per identificare varianti de novo .

4. miniprep di DNA per elettroporazione In Utero

1. Progettare diversi breve tornante RNAs (shRNA) targeting la sequenza codificante o 3' UTR dei geni candidati come descritto in precedenza²².
2. Per evitare fuori bersaglio effetti testare shRNA specificità ricerca BLAST contro il database utilizzando i metodi standard. Escludere shRNA visualizzati da più di 50% di complementarità con altri geni di ratto.
3. Oligonucleotidi clone ricotto in un vettore di mU6-pro come descritto in precedenza²³.
4. Purificare il plasmide DNA con un Maxi-prep secondo le istruzioni del produttore e fare una concentrazione finale di 3 µ g / µ l.
5. Aliquota 20 µ l di DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP o costruire da soli o con 1,5 mg/ml di shRNA) e aggiungere 2 µ l di Fast verde colorante (2 mg/mL) per consentire il controllo visivo dell'iniezione.

5. nell'Utero elettroporazione

1. Procedura chirurgica
   1. Anestetizzare E15.5 incinto ratti femminili (E0 è stato definito come il giorno della conferma della plug vaginale sperma-positivi), utilizzando una combinazione con una miscela di chetamina/xilazina (0,1 e 0,01 mg al corpo peso, rispettivamente), che è dato tramite un intraperitoneale iniezione per l'induzione anestetica.
   2. Assicurarsi che l'animale è completamente anestetizzato osservando la scomparsa del riflesso di pizzico di punta.
   3. Radere l'addome più basso dell'animale con un clipper per rimuovere il pelo. Disinfettare la pelle con scrub di povidone-iodio e alcool al 70%. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre nell'ambito dell'anestesia.
   4. Metti l'animale su una fonte di calore e mettere un telino sterile (con una finestra aperta di 4-5 cm in mezzo) sopra il sito di incisione. Indossare maschere, camice da laboratorio, Berretti e guanti chirurgici sterili. Mantenere la sterilità fino alla fine della chirurgia.
   5. Utilizzando delle forbici affilate per praticare un'incisione verticale (2-2.5 cm) in pelle lungo la linea mediana nella parte caudale dell'addome e poi fare un'incisione della parete muscolare sotto la pelle — anche di 2,5 cm — lungo la linea mediana.
   6. Esporre con attenzione un corno uterino dalla cavità addominale. Goccia di soluzione salina normale pre-riscaldato a 37 ° C per idratare gli embrioni. Mantenere l'utero umido tutto il tempo.
2. Iniezione di DNA e di elettroporazione
   1. Uno dei corni uterini premere delicatamente con il forcipe anellato e spingere con cautela un embrione alla parete uterina. Tenere l'embrione in una mano e con l'altra mano inserto accuratamente tubi capillari in vetro 1 mm dalla linea mediana nel ventricolo laterale sinistro (2-3 mm di profondità) e iniettare circa 1 µ l di DNA con Fast Green per consentire il controllo visivo dell'iniezione utilizzando un microinjector.
   2. Goccia normale soluzione salina sulla superficie di elettrodi² 3 x 7 mm. Posizionare l'elettrodo positivo sterile sul lato iniettato (ventricolo laterale di sinistra) e l'elettrodo negativo sterile il ventricolo di destra. Fornire 5 impulsi elettrici a 950 ms intervalli con un pedale del piede-controllato (4000 condensatore mF 40 V con un electroporator a carico).
3. Elettroporazione procedure post
   1. Rimettere i corni uterini alla cavità addominale, aggiungere gocce di soluzione salina normale alla cavità per permettere embrioni posizionati più naturalmente e per tenere conto per la perdita di fluido intraoperatoria.
   2. Chiudere la parete muscolare addominale con suture chirurgiche assorbibili, quindi la pelle usando un punto semplice-interrotto.
   3. Mettere il ratto torna alla gabbia e monitorare l'animale fino a quando emerge dall'anestesia.
   4. Per la gestione del dolore somministrare buprenorfina (0,03 mg/kg) all'animale mediante un'iniezione sottocutanea ogni 8-12 h, fino a 48 h.

6. preparazione del campione cervello

1. Metodo di fissazione
   1. Sacrificare il ratto incinto 5 giorni dopo la procedura chirurgica usando l'anestesia di gas (isoflurano) seguita da una rapida dislocazione cervicale.
   2. Praticare un'incisione verticale di riaprire la cavità addominale.
   3. Esporre i corni uterini, rimuovere gli embrioni dall'utero e decapitare loro utilizzando delle forbici affilate.
   4. Rimuovere il cervello con minimo danno al tessuto: utilizzando delle forbici affilate, praticare una piccola incisione lungo la parte posteriore (cervelletto) / asse anteriore (lampadina olfattiva) della testa a forare la pelle e il cranio, quindi utilizzando un paio di pinze staccarsi il cranio per esporre il cervello e rimuoverlo utilizzando una piccola spatola.
   5. Immergere il cervello durante la notte a 4 ° C in un 4% paraformaldeide in 1x tampone fosfato salino (PBS).
2. Cervello di sezionamento
   1. Lavare il cervello in 1X PBS per 10 min.
   2. Incorporare cervelli in 4% agar in plastica stampi di incorporamento.
      1. Preparare 50 mL di 4% agar in 1X PBS per l'incorporamento 5 cervelli embrionali. Garantire che disciolto dell'agarosi sono a non più di 50 ° C.
   3. Mantenere il cervello in agarosio per polimerizzare per almeno 1 h a 4° C. Rimuovere l'eccesso dell'agarosi intorno al cervello.
   4. Incollare il cervello per la piastra di base del vibratome, orientato quindi l'asse anteriore/posteriore del cervello è perpendicolare alla lama. Attendere alcuni minuti che la colla asciughi e posizionare la piastra con il cervello incollato nella camera del vibratome.
   5. Riempire il vibratome con PBS 1X. Affettare 100 µm sezioni spesse.
   6. Trasferire le fettine di cervello su diapositive, rimuovere il liquido in eccesso, aggiungere poche gocce di mezzo di montaggio e collocare un vetrino coprioggetto sopra cervelli

7. confocale Imaging e l'analisi quantitativa

1. Permette il montaggio supporto a secco durante la notte prima di imaging. Sezioni di immagine a 10 volte su un microscopio confocale a scansione laser.
2. Utilizzando software per analisi quantitativa delle immagini, convertire l'immagine in 8-bit, selezionare un rappresentante GFP positivo fluorescente delle cellule e definire manualmente la forma. A tale scopo, fare clic su "Preventivo" e disegnare il bordo della cella utilizzando lo strumento selezione a mano libera. In questo modo il diametro e la soglia di intensità della cella vengono mantenute automaticamente dal software.
3. Fai clic su "Find cellule" per consentire al software localizzare le cellule transfected in tutta la corteccia. Quindi, se necessario, rimuovere manualmente falsi positivi.
4. Dividere l'intero spessore della corteccia in 8 aree di interesse normalizzato in singole sezioni. A tale scopo, fare clic su "Strumento di regione", selezionare 8 "regione Stripes" dove il primo (1) e l'ultimo (8) strisce corrispondono rispettivamente a VZ e alla parte superiore del CP. Fare clic su "Applica" per consentire al software contare la posizione relativa delle cellule transfettate GFP nella corteccia intera. Infine clicca su "Salvare la quantificazione" per esportare i dati in un file di Excel per l'analisi.

Risultati

La strategia sperimentale progettata per identificare nuovi geni causativi di MCD è ricapitolata nella Figura 1.

Eseguendo l'array-CGH in una coorte di 155 pazienti con anomalie dello sviluppo cerebrale combinando variamente PNH (Figura 2A), disgenesia del corpo calloso, colpocephaly, ipoplasia cerebellare e la polimicrogiria associata a epilessia, atassia e danno conoscitivo, abbiamo identific...

Discussione

MCDs sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% di epilessia resistente alla droga infanzia^1,2. Interesse in MCDs sono aumentato drammaticamente durante la decade passata a causa di due fattori principali. Il primo è il miglioramento nel cervello (in particolare RMN), che consente a medici e scienziati di visualizzare molte malformazioni cerebrali che precedentemente non sono state riconosciute. L'altro è l'evoluzione di strumenti ge...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine