Мышь Модель Ретинального ишемией реперфузии через Elevation внутриглазного давления

Резюме

В данной статье описана процедура для индукции сетчатки травмы ишемии-реперфузии путем повышенного внутриглазного давления у мышей. Сетчатки травмы ишемии-реперфузии повышенным внутриглазным давлением служит для моделирования патологий человека, характеризуемых скомпрометированы кислорода и доставки питательных веществ в сетчатке, что позволяет исследователям изучить потенциальные клеточные механизмы и способы лечения заболеваний человека сетчатки нейрососудистое единицы.

Аннотация

Ретинальная ишемия-реперфузионное (I / R) представляет собой патофизиологический процесс, способствующий разрушению клеток в нескольких глазных состояний, в том числе глаукома, диабетическая ретинопатия и сетчатки глаза закупорки сосудов. Грызун модели травмы I / R обеспечивают значительное понимание механизмов и стратегий лечения для человека I / R травмы, особенно в отношении нейродегенеративных повреждений в сетчатке нейрососудистых блока. Представленные здесь протокол для индукции сетчатки травмы I / R у мышей через возвышение внутриглазного давления (ВГД). В этом протоколе, глазное переднюю камеру канюлю с иглой, через который протекает потек повышенной солевой резервуар. С помощью этого капельного поднять ВГД выше систолического артериального давления, практикующий временно останавливает внутреннюю кровотока в сетчатке (ишемия). Когда циркуляция восстанавливается (реперфузии) путем удаления канюли, тяжелые повреждения клеток наступает, в результате чего в конечном счете, в нейродегенерации сетчатки глаза. Последние шпильких годов демонстрируют воспаление, проницаемость сосудов и капилляров вырождение в качестве дополнительных элементов этой модели. По сравнению с другими методиками сетчатки глаза I / R, такие как сетчатке артериальном перевязки, I сетчатке / травмы R повышенным ВГД дает преимущества в своей анатомической спецификой, экспериментальной сговорчивости и технической доступности, представляя себя как ценный инструмент для изучения нейронную патогенеза и терапии в сетчатки нейрососудистым блок.

Введение

Ретинальной ишемии-реперфузии (I / R) , характеризует многие патологии человека, в том числе к сетчатке глаза глаукома, диабетическая ретинопатия и сетчатке закупорки сосудов ^1. В сетчатке I / R, снижение кровотока (ишемия) в сосудистой сети сетчатки создает состояние повышенной чувствительности сетчатки глаза к кислороду и других питательных веществ, ускоряя тяжелую оксидативного и воспалительного повреждения при циркуляции впоследствии восстановлен (реперфузия) ^2. Нейронная сетчатка представляется особенно уязвимы к этим изменениям, с нейродегенеративные сетчатки глаза, возможно, наиболее характерной особенностью I / R-индуцированного повреждения. Представленные здесь протокол для моделирования травмы сетчатки I / R в мышь. Этот метод позволяет исследователям изучить возможные механизмы и стратегии лечения для человека заболеваний сетчатки глаза нейрососудистых единицы.

Pioneered в 1952 году хирурги стремятся понять нейродегенеративные последствия хирургической анемии ^3, Родент I ретиналь / R от повышенного внутриглазного давления (ВГД) был восстановлен в 1991 году с целью стандартизации нейродегенеративных конечных точек после ишемического инсульта ^4. Использование капельного солевого резервуара для повышения ВГД выше систолического артериального давления, эти исследования показали, что под давлением глазного канюляция было достаточно, чтобы приостановить циркуляцию сетчатки глаза и тем самым инициировать дегенерацию нейронов. Более поздние попытки с использованием сетчатки глаза I / R с повышенным ВГД начали разрабатывать механизмы , лежащие в основе I / нейродегенера- ^5-12 сетчатки R-индуцированной. Несколько групп сообщили дополнительные патологические изменения , включая воспаление ^13,14, проницаемость сосудов ^15,16 и капиллярного дегенерации ^14,17. Взятые вместе, эти исследования установили сетчатки глаза травмы I / R по повышенным ВГД как модель сетчатки глаза нейрососудистых болезни в более общем плане.

Характеризуя механизмы травмы I / R имеет важное значение для изучения ваscular болезнь. Сетчатки травмы I / R с повышенным ВГД является одной из многих моделей травмы гипоксией индуцированных, в том числе I / R травмы в легких ^18, сердце ^19, мозг, печень ^{20 21,} почки ²² и кишечника ^23. Эти модели были первостепенное значение в продвижении нашего понимания сосудистой болезни и ее клинические средства правовой защиты. Расширяя исследование I / R процессов в тканях глаза, я сетчатке / R травмы повышенным ВГД помогает нарисовать более полную картину этих родственных условий.

Корреспондент в тесном сотрудничестве с клиническими нейродегенеративных состояний в сетчатке, I сетчатки / R травмы повышенным ВГД представляет собой ценный инструмент для исследователей, заинтересованных в изучении патогенеза ишемического. Протокол, описанный здесь, предназначен, послушной, и доступным. Он дополняется хорошо концами в дегенерации нейронов, таких как количественной оценке нейронов сетчатки, измерение толщины сетчатки и электрофизиологических гапись сетчатки функции нейронов. Эта модель доказала свою полезность в продвижении сосудисто-нервный запрос, и это показывает обещание в получении статуса в качестве основополагающего протокола в визуальном исследовании медицины.

протокол

Заявление по этике: Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Институциональная уходу и использованию животных комитета Университета Джона Хопкинса по.

Примечание: Мыши, используемые во время съемки являются C57BL / 6 мышей из Jackson, хотя также могут быть использованы другие штаммы или виды грызунов. При использовании других штаммов или видов, следует помнить, что анестезия дозы и травмы график может меняться. Важно адаптировать условия I / R, чтобы разместить нагрузку, виды и экспериментальные варианты.

1. Подготовьте коктейль Анестезия

1. Смешайте 1,25 мл кетамина 0,625 мл ксилазином 0,375 мл Ацепромазин и 22,75 мл фосфатно-солевой буфер в центрифужную пробирку на 50 мл.
   Примечание: В оставшейся части рукописи, это решение будет называться коктейлем.
2. Фильтр коктейль в новую стерильные 50 мл центрифужную пробирку с помощью шприца на 60 мл и фильтр 0,20 мкм. Этикетка и дата эта новая Tuбыть.
3. Полностью обернуть коктейль трубу алюминиевой фольгой для предотвращения вызванной действием света деструкции анестетика.
   Примечание: Коктейль можно хранить при комнатной температуре и не использовать повторно до истечения срока его ранней-истекающим ингредиента.

2. Подготовьте анестезию Booster

1. В центрифужную пробирку 50 мл, смешайте 4 мл кетамина и 16 мл фосфатно-солевой буфер.
   Примечание: данное решение будет в дальнейшем упоминаться как бустер.
2. Фильтр бустера в новую стерильные 50 мл центрифужную пробирку с помощью шприца на 60 мл и фильтр 0,20 мкм. Этикетка и дата эта новая трубка.
   Примечание: Ракета-носитель может храниться при комнатной температуре и не использовать повторно до истечения срока его ранней-истекающим ингредиента.

3. Подготовьте Хирургическая Люкс

1. Установите комнатную температуру между 18 ° C и 21 ° C.
2. Включите хирургический стол, и регулировать его поверхности тепла к ВЫСОй температуры.
3. Накройте все поверхности работать с хирургическими гкие.
4. Расположить пустую клетку или другой контейнер на операционном столе, чтобы нагреться.
5. Устройте масштаб и Tagger уха на столешнице.

4. Подготовить сбалансированный солевой раствор с гепарином натрия

1. Добавьте 0,5 мл гепарина натрия в IV флакон 500 мл сбалансированного солевого раствора (HBSS).
2. Вставьте острый конец основного набора prepierced Y-сайт трубки в бутылку 0,1% гепарина натрия.

5. Настройте IV полюс

1. Повесьте бутылку 0,1% гепарина натрия с расширением IV полюса, и оснастке откройте крышку воздушного фильтра на первичном наборе prepierced Y-сайт трубки.
2. Приподнимите 0,1% бутылка гепарин натрия до 163 см (120 мм рт.ст.). Измерьте высоту от поверхности стола до пика гепарин натрия капельно.
3. Удалите все пузырьки воздуха в IV трубки вручную щелкать основной набор prepierced Y-сайт трубки.

6. Настройте натрия гепарин Капельное

1. Подключите основной набор prepierced Y-сайт трубки к коллектору пять клапанов.
2. Подключение 30 калибра ½ дюйма иглы к коллектору пятиполюсника использованием Луер самца к Luer мужской трубные фитинги.
3. Вставьте каждый из 30-го калибра ½ дюйма иглы в свой собственный 10-дюймовый сегмент 30-го калибра трубки.
4. Используя кровоостанавливающих, поломку иглы советы от новых 30 калибра ½ дюйма иглы и вставить их тупые концы в 30-го калибра трубки. Стерильность или дезинфекция кончиках игл будет необходимо для шага 8.3.
5. С помощью ленты, расположить 30 калибра трубки с иглами таким образом, что трубки, соединенные с внутренними отверстиями, расположенными в верхней части трубок, соединенных с внешними портами. Такое расположение позволит предотвратить спутывание труб во время пункции передней камеры.
6. Включите 0,1% расхода гепарин натрия в коллектор с пятью клапана и к каждому отдельному порту.
   1. Убедитесь в том, что 0,1%гепарин натрия сильно течет для каждого порта. Если порт слабо течет, замените порт или снимите его с воздухом из стерильных шприцев.
   2. Дайте 0,1% гепарин натрия протекать в течение 2 - 3 мин для удаления пузырьков воздуха из 30-калибровочных трубок и 5-клапанный коллектор.
7. Выключите все порты на коллекторе 5-клапана.

7. Подготовьте Мыши для хирургии

1. Принесите мышей к хирургическому свиты. ВОДОСНАБЖЕНИЕ бутылки для каждой клетки, чтобы предотвратить обезвоживание организма животного во время операции.
2. Записывают массу каждой мыши.
3. Вводят каждой мыши внутрибрюшинно 0,02 мл коктейля на грамм веса тела.
4. Tag и записывать количество каждой мыши.
5. Поместите все мыши в пустой контейнер на столе хирургии. Разрешить 5-10 минут для всех мышей, чтобы достичь глубокого обезболивание, что подтверждается отсутствием реакции снятия педали до ног крайнем случае.
6. Для каждой мыши, администрировать одну каплюTropicamide в каждый глаз для расширением зрачка и кратковременной смазки.
7. Для каждой мыши, администрировать одну каплю пропаракаина в каждый глаз для местной анестезии и кратковременной смазки.
8. Устройте мышей в порядке обезболиванием таким образом, чтобы быть под наркозом будет первая мышь первая мышь, чтобы быть канюлю.
9. Разрешить примерно 2 мин для глазных капель вступили в силу.
10. Подготовьте прямые 4-дюймовые части ленты, потянув плотно на ленте. Отложите один кусок ленты для каждой мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии плотно натянуть на ленте приведет к скручиванию ленты.

8. вводить иглу в переднюю камеру

1. Устроить первую мышь под хирургическим микроскопом и сфокусировать микроскоп на предпочтительном роговицей.
   Примечание: катетеризацию могут быть выполнены на каждом глазу. Правые доминирующие хирурги могут найти Iт легче вводить иглу в левый глаз, в то время как левая доминирующие хирурги могут предпочесть право.
2. Включите первую 0,1% портом Гепарин натрия на коллекторе пять клапана.
3. Под хирургическим микроскопом используйте пару щипцов, чтобы мягко proptose глаз. Вставьте 30-калибровочную иглу канюли в переднюю камеру примерно на полпути между пояском волокон и верхушки роговицы.
   1. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать или прокалывания диафрагмы, объектив, или внутреннюю поверхность роговицы.
   2. Избегайте проникновения роговице во второй раз.
   3. Используя нежную вращательным движением, чтобы преодолеть трение между канюлей и роговицей, вставьте канюлю глубоко в передней камере.
4. Используйте полосу ленты, чтобы обеспечить 30-калибровочную трубку к столу. Чтобы свести к минимуму перемещение вставленной канюли, нажмите 30 калибра трубки против столешнице при достижении для ленты.
5. Запишите время начала операции.
6. С помощью микроскопа, VERIFу, что никакой утечки не видно. Если утечка присутствует, то движение жидкости будет виден вблизи глаз.
7. Визуально подтверждают глазное вздутия, заметив, что I / R глаз больше, чем контралатерального глаза. Вместе, отсутствие утечек и наличие глазного вздутием демонстрируют успешное повышение внутриглазного давления.
8. Нанесите гипромеллозу на обоих глазах. Hypromellose служит для смазывания роговицы и уплотнения microleaks. Повторное применение гипромеллоза по мере необходимости (примерно через каждые 30 мин) в течение длительного смазывания.
9. Повторите шаг 8 до тех пор, пока все животные были канюлю.

9. Монитор Анестезия

1. С помощью ног крайнем случае, визуальное наблюдение усов или визуальное наблюдение за хвост, чтобы убедиться, что каждая мышь остается под наркозом. Если мышь демонстрируют педаль ответ на снятие, усов подергивания, или хвост движения, переходите сразу к шагу 9.2.
2. Если мышь начинает пробуждаться во время операции, лифтхвост, чтобы ввести 0,05 мл бустер внутрибрюшинно в нижнюю часть живота из-за мыши. Разрешить 1 - 2 мин для бустер вступили в силу.
3. Если мышь требует дополнительного седативного эффекта, повторите шаг 9 по мере необходимости.

10. Снимите канюлей из передней камеры

1. Для каждого животного через 90 мин прошло, осторожно вытяните канюлю из передней камеры.
2. Untape мышь от операционного стола, следя за тем, чтобы не нарушить канюлей трубки соседних животных.
3. Смажьте оба глаза с смазочное желе.
4. В последующие канюль удаляются, устройте мышей в пустом контейнере на операционном столе, чтобы восстановиться после операции. Не выключайте тепло операционного стола.
5. Разрешить, как минимум, 2 - 3 часа для восстановления на операционном столе с подогревом. Обратите внимание на мышей часто, пока они не полностью оправился от наркоза.

11. Очистите уравнениеНАС ТРОЙКА

1. Дезинфекция с помощью канюль спиртовые салфетки.
   Примечание: Другие способы дезинфекции или стерилизации, такие как автоклавирование, может быть замещен.
2. Выгнать 0,1% гепарина натрия от коллектора 5-клапанный, 30 калибра иглы, 30 калибра трубки и канюли с помощью 60 мл шприц, заполненный воздухом.
3. Промыть коллектор 5-клапанный, 30 калибра иглы, 30 калибра трубки и канюли с помощью 60 мл шприц, заполненный дистиллированной водой.
4. Expel дистиллированную воду из коллектора 5-порта, 30-калиброванными иглами, 30-го калибра трубки и канюль с помощью шприца на 60 мл, заполненный воздухом.
5. После дезинфекции и промывки канюль устройства насосно-компрессорных труб, хранить это оборудование для повторного использования.
6. Магазин, выбросить или выключить все другое оборудование. Оставьте тепло на операционном столе.

12. Возврат всех мышей в их клетки

1. После того, как мыши, пробуждаться после операции (через 2 - 3 ч), возвращают каждое животное в родную клетку, Обеспечить гель пищи для каждой клетки. Возвращение все клетки в отведенных им помещениях.
2. Выключите огонь хирургического стола. Выбросьте все отходы, и вытирать хирургический набор.

13. Выполните оценку Сетчатки

1. В случае необходимости, собирать сетчатку для гистологического анализа или темной адаптации мышей для записи электроретинограмму.

Результаты

Нейродегенеративные эффекты сетчатки глаза I / R по повышенным ВГД обычно оцениваются с использованием двух стандартных подходов. NeuN иммуномечение нейронов ядер показало значительную потерю нейронов клеток после I / R инсульта (рисунок 1). Если коротко, то глаз?...

Обсуждение

Сетчатки I / R травмы повышенным ВГД доказала свою полезность при моделировании клеточных повреждений и дисфункции, в частности, нейродегенерации, в грызуна блоке нейрососудистых сетчатки. Эта процедура обеспечивает надежную контрольную ткань и легко доступны с точки зрения техническ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Injection, USP	Abraxis Pharmaceutical Products		1,000 USP/ml
BSS Sterile Irrigating Solution	Alcon Laboratories, Inc.	9007754-0212	500 ml
SC-2 kg Digital Pocket Scale	American Weigh Scales, Inc.	SC-2 kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1%	Bausch + Lomb		1% (10 mg/ml)
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5%	Bausch + Lomb		0.5% (5 mg/ml)
INTRAMEDIC Polyethylene Tubing	Becton Dickinson and Company	427400	Inner diameter: 427400
30 G 1/2 PrecisionGlide Needles	Benton Dickinson and Company	305106
BC 1 ml TB Syringe, Slim Tip with Intradermal Bevel Needle, 26 G x 3/8	Benton Dickinson and Company	309625
BD 60 ml Syringe Luer-Lok Tip	Benton Dickinson and Company	309653
Zeiss OPMI Visu 200/S8 Microscope	Carl Zeiss AG	000000-1179-101
Sterile Syringe Filter	Corning Inc.	CLS431224	0.20 µm
Durasorb Underpads	Covidien	1038	23 x 24 inches
Alcohol Prep	Covidien	6818	2 Ply, Medium
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Hartman Hemostats	Fine Science Tools	13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 Inch	Hospira	12672-28
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1x)	Invitrogen	10010-049	500 ml
Distilled water	Invitrogen	15230-204	500 ml
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664
AnaSed Injection: Xylazine Sterile Solution	LLOYD, Inc.		20 mg/ml
Lubricating Jelly, Water Soluble Bacteriostatic	MediChoice		3-Gram Packet
NAMIC Angiographic Pressure Monitoring Manifold	Navilyst Medical, Inc.	70039355	5-Valve Manifold with Seven Female Ports
Goniosoft, Hypromellose 2.5% Ophthalmic Demulcent Solution: Hydroxypropyl Methylcellulose	OCuSOFT, Inc.		2.5% (25 mg/ml)
Ketaset CIII: Ketamine Hydrochloride	Pfizer, Inc.		100 mg/ml
Trans-Pal I.V. Stand	Pryor Products	372	Furnished with a home-constructed 60-cm stainless steel extension
Acepromazine: Acepromazine Maleate Injection, USP	Vet One		10 mg/ml
V-Top Surgery Table/Adjustable Hydraulic	VSSI	100-4041-21
Tube Fitting Luer Male to Luer Male	Warner Instruments	64-1579