Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

Riepilogo

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Abstract

Nella chirurgia ricostruttiva, vi è una necessità clinica di un'alternativa ai metodi attuali di ricostruzione autologo che sono complessi, costosi e commercio un difetto per un altro. L'ingegneria dei tessuti mantiene la promessa di affrontare questa crescente domanda. Tuttavia, la maggior parte delle strategie di ingegneria tissutale non riescono a generare sostituti stabili e funzionali dei tessuti a causa della scarsa vascolarizzazione. Questo documento si concentra su una ingegneria dei tessuti modello in vivo della camera di vascolarizzazione intrinseca in cui un'arteria perfusione e una vena o come un ciclo artero o di una configurazione peduncolo a flusso continuo è diretto all'interno di una camera cava protetta. In questo sistema camerale basato germinazione angiogenica verifica dai vasi arterovenose e questo sistema attrae migrazione cellulare endogena ischemica e infiammatoria motore che riempie progressivamente spazio della camera con tessuto fibro-vascolare. cellula esogena / matrice impianto al momento della costruzione della camera migliora sur cellularevivenza e determina la specificità dei tessuti ingegnerizzati che si sviluppano. I nostri studi hanno dimostrato che questo modello camera può generare con successo diversi tessuti come grasso, muscolo cardiaco, fegato e altri. Tuttavia, sono necessarie modifiche e perfezionamenti per garantire tessuto bersaglio formazione è coerente e riproducibile. Questo articolo descrive un protocollo standardizzato per la realizzazione di due differenti modelli a camera ingegneria tissutale vascolarizzate in vivo.

Introduzione

Fabbricazione del tessuto vascolarizzato funzionale utilizzando un approccio di ingegneria dei tessuti è un paradigma emergente nel campo della medicina rigenerativa. ^1,2 Molti approcci di ingegnerizzare tessuti nuovi e sani per la sostituzione di tessuto danneggiato o organi difettosi sono stati sviluppati, ^3-6 sperimentalmente in modelli animali di piccole dimensioni con promettente potenziale clinico. ^7,8 Tuttavia, vascolarizzazione rimane una delle grandi sfide per l'ingegneria dei tessuti che limitano il potenziale per crescere tessuti di dimensioni clinicamente rilevante. ⁹

Gli attuali approcci per vascolarizzano tessuto seguire sia una via estrinseca in cui i nuovi vasi crescono da letto vascolare destinatario e invadono tutto il tessuto impiantato costruisce ¹⁰ o un percorso di vascolarizzazione intrinseca dove il sistema vascolare cresce e si espande in sintonia con il tessuto di recente sviluppo. ¹¹ L'approccio estrinseca coinvolge tradizionalmente le cellule di semina su una impalcaturain vitro e impiantare il costrutto completo nella animale vivente con l'aspettativa che i nutrienti, in precedenza forniti da terreni di coltura, sarà acquistato dalla circolazione. ^12,13 Il concetto è semplice come crescita interna vascolare è troppo lento e solo gli impianti molto sottili (< di spessore 1-2 mm) rimane valida. Fornire sostanze nutritive e ossigeno per mezzo di una vascolarizzazione sufficiente e rapida è al centro di tutti i tentativi riusciti a crescere sostituti tissutale più complesse e più grandi, come ossa, muscoli, grasso e gli organi solidi. ^14,15 vascolarizzazione intrinseca offre il potenziale per costrutti più grandi per lo sviluppo dalla crescita di tessuto progressiva compatibile con la sua espansione apporto di sangue. Un disegno è l'impianto in vivo in una camera di un peduncolo vascolare con o senza un ponteggio seminato cellule. ^5,6 Questo ha aperto la strada a nuove procedure per la generazione di tessuti intrinsecamente vascolarizzati spessi. ^16,17

Più recentemente, sono state sviluppate strategie di pre-vascolarizzano innesti di tessuto, prima dell'impianto. Queste reti dei vasi sanguigni incorporate hanno lo scopo di inosculate con vasi di accoglienza presso l'impianto consentono la rapida fornitura di un apporto di sangue completo per migliorare la sopravvivenza di tutte le parti di un innesto di tessuto spesso trapiantato. ¹⁸

Siamo stati pionieri di un vascolarizzato vivo modello in ingegneria dei tessuti nei piccoli animali che coinvolge una via sottocutanea impiantato semirigido camera chiusa contenente un peduncolo vascolare perfusione e biomateriali cellulari contenenti. La camera crea un ambiente ischemico che stimola sprouting angiogenico dai vasi impiantati. ³ Il peduncolo vascolare può essere un ciclo arterovenosa ricostruite o un'arteria flusso continuo intatta e vena. ^3-6,19 This vascolari germogli peduncolari un funzionamento ed estesa artero rete -capillary-venosa che collega sia l'arteeriole e venoso si conclude con il peduncolo vascolare. ^3,20, inoltre, la circostante camera di supporto cava protegge il tessuto in via di sviluppo da potenzialmente deformare forze meccaniche e prolunga l'unità ischemico per migliorare la vascolarizzazione. ^3,21,22 Se il peduncolo nave è semplicemente impiantato in tessuto normale e non all'interno dello spazio protetto della camera, germinazione angiogenico cessa lungo la stessa timeline come una ferita normale e nessun nuovo tessuto si accumulano intorno al peduncolo. Gli investigatori hanno utilizzato questa configurazione in vivo per produrre costrutti di tessuto tridimensionali funzionali vascolarizzati con vascolarizzazione di sostegno e di dimensioni clinicamente rilevante. ^4,23 Inoltre, i costrutti di tessuto vascolarizzate ingegnerizzati con il suo peduncolo vascolare intatto possono essere raccolti per il successivo trapianto presso il sito della lesione . ^24,25 Uno scenario più clinicamente fattibile sarebbe la creazione della camera presso il sito definitivo per la ricostruzione sale come il petto. Così, questa de novo tessuto approccio ingegneristico potrebbe avere potenziale clinico di fornire una nuova fonte di tessuto bersaglio funzionale per la chirurgia ricostruttiva. ^26-28

Il seguente protocollo fornirà una guida generale per costruire un vascolarizzati camera di ingegneria tissutale in vivo nel ratto, che potrebbe essere adattato in diversi modelli animali e impiegato per esaminare i processi complicati dell'angiogenesi, produzione della matrice, e la migrazione e la differenziazione cellulare.

Protocollo

I protocolli descritti qui sono stati approvati dal Comitato Etico Animal Hospital di Melbourne di San Vincenzo, in Australia, e sono state condotte in stretta aderenza alle linee guida Australian National sanità e ricerca medica del Consiglio.

NOTA: due protocolli della camera sono descritti di seguito. I due modelli diversi e loro disegni camera specifici sono illustrati in Figura 1. Sezione (1) è realizzato in policarbonato (per il modello camera di ciclo di ratto artero). È cilindrico con diametro interno 13 mm e altezza 4 mm. Una finestra a un certo punto nel muro consente l'accesso senza ostacoli per il peduncolo. Nel secondo modello (per flusso continuo ratto modello camera peduncolo), la camera è realizzata poliacrilici e è rettangolare (10 x dimensioni 8 x 4 mm ³ interne). Ha due aperture 1,5 mm sui lati opposti per accogliere l'arteria femorale e la vena quanto trasgrediscono la camera.

1. Rat artero-Loop Modello Camera (One Chamber per animale)

NOTA: Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che tutti gli strumenti siano stati correttamente sterilizzati. Allo stesso modo, assicurano il resto strumenti su asciugamani sterili e sono ad una distanza ragionevole dal campo operatorio per evitare la contaminazione durante la procedura.

1. Preparazione del Animal per la chirurgia
   1. Utilizzare ratti peso di almeno 250 g per le grandi dimensioni delle navi per la realizzazione del ciclo artero.
   2. Anestetizzare l'animale con il 4% inalazione isoflurano. Corroborare un'adeguata profondità dell'anestesia valutando refrattarietà alla punta-pizzico. Dopo l'anestesia, tenere l'animale adeguatamente anestetizzato durante tutta la procedura con il 2% isoflurano.
   3. Posto l'animale in posizione supina su un blocco riscaldante e applicare il lubrificante sterile per gli occhi per prevenire l'essiccamento durante l'intervento chirurgico.
   4. L'utilizzo di un rasoio elettrico, la barba sia inguini e rimuovere i capelli con un pezzo di garza umida.
   5. Preparare i siti chirurgici con clorexidina/ Soluzione di etanolo al 70% e drappeggio l'animale con teli sterili. Somministrare una singola dose di Carprofen (5 mg / kg, per via sottocutanea) come analgesico.
2. Raccolta di vena femorale Graft
   1. Utilizzando una lama # 15, fare un lungo 4 cm incisione cutanea sulla all'inguine sinistro parallelo al legamento inguinale. Ciò espone il cuscinetto adiposo inguinale.
   2. Tagliare il cuscinetto adiposo circonferenziale con le forbici lasciandola attaccata al suo peduncolo vascolare sulla base dei vasi epigastrici.
   3. Utilizzando le forbici micro, liberare le aderenze del tessuto connettivo vaporosi tra la parete addominale e vasi femorali sottostanti.
   4. Posizionare un divaricatore sulla parete addominale e tirare mediale. Ciò espone il legamento inguinale e tutta la lunghezza dei vasi femorali.
   5. Utilizzando micro pinze e forbici curve sezionare la vena epigastrica e isolarlo dal suo grasso circostante tirando e taglio con delicatezza. Questa vena agisce come un tether nel costruire il ciclo.
   6. usinG Micro pinze e micro forbici curve aprire la guaina perivascolare che contiene i vasi femorali e dei nervi tutta la strada dal legamento inguinale alla sua distale biforcazione al ramo epigastrica.
   7. Utilizzando micro pinze, prendere la vena femorale per la sua avventizia e delicatamente separarlo dai tessuti circostanti e di accompagnamento delle arterie. Fare questo con una pinza micro e curve micro forbici rotonde punte tirando il tessuto a parte e taglio attraverso di essa.
      NOTA: Non afferrare tutto lo spessore della parete venosa come questo potrebbe causare traumi alla intima che lo rende incline alla trombosi.
   8. rami laterali legare trovato durante la dissezione con 10/0 sutura in nylon o coagulano con un coagulatore bipolare.
   9. Con la vena femorale completamente libero, legare la sua estremità prossimale e distale con 4/0 punti di sutura in seta. Assicurarsi di ottenere una vena innesto di almeno 10 mm di lunghezza e comprende circa 0.5 cm Lunghezza del ramo epigastrica per essere usato come un tether corda ragazzoper tenere l'anello aperto nella camera.
   10. Utilizzando pinze micro e micro forbici diritte, tagliare l'avventizia dalla estremità del trapianto tirando e tagliando delicatamente. Questo può essere fatto anche in seguito, prima di anastomosi microchirurgiche.
   11. Lavare l'innesto della vena con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U / ml di eparina) e lasciare riposare nella soluzione. Chiudere la ferita con funzionamento continuo 4/0 sutura di seta più due o tre ulteriori semplici punti interrotti.
3. Creazione di arterovenose Loop e l'impianto della Camera
   1. Ripetere i passaggi da 1.2.1 a 1.2.4 in esattamente allo stesso modo sull'arto controlaterale.
   2. Utilizzando micro pinze, sezionare e isolare sia l'arteria epigastrica e la vena formare il cuscinetto adiposo circostante. Per fare ciò, tirando delicatamente il tessuto lontano da vasi
   3. Utilizzando micro pinze, prendere l'arteria femorale dal suo avventizia e liberarla dai tessuti circostanti. Fare questo con una pinza micro e curvo mic rotonda punteforbici ro tirando il tessuto a parte e taglio attraverso di essa. Legare o coagulare i suoi rami laterali.
   4. Legare l'arteria femorale e la vena distale alla nascita dei vasi epigastrici utilizzano 4/0 di seta di sutura.
   5. Posizionare un morsetto prossimalmente su ciascuna arteria femorale e la vena. Utilizzando un forte dritto micro forbice, fare una trasversale pulito tagliato in ogni distale nave alla nascita dei rami epigastrico. Posizionare un contrasto di fondo di plastica sterile sotto i vasi.
   6. Lavare le navi energicamente con abbondante soluzione salina eparinizzata finché tutto il sangue viene rimosso dal lume.
   7. Portare l'innesto della vena nel campo operatorio e rimuovere eventuali avventizia esubero dalle estremità delle navi di cui al punto 1.2.10, se necessario.
   8. Eseguire entrambe le anastomosi microchirurgiche con 10/0 sutura in nylon. Anastomose l'estremità prossimale della vena graft alla vena femorale e l'estremità distale all'arteria femorale. Questo permetterà al sangue di fluire fROM arterioso al lato venoso senza resistenza dalle valvole all'interno del trapianto vena.
      NOTA: Assicurarsi che i vasi femorali e della vena trapianto resto nella loro posizione naturale, senza colpi di scena.
   9. Controllare eventuali perdite in entrambi i siti anastomosi. Risolvere piccole perdite, che sembrano non pulsante il sangue che esce dal sito anastomotico, mettendo un piccolo pezzo di grasso sulla parte superiore e delicatamente compressione per 5-10 min. Grandi perdite pulsanti che rapidamente inondano l'intero campo avranno bisogno di punti di sutura aggiuntivi.
   10. Controllare la pervietà del ciclo artero-venosa. occlusione Gentle dell'arteria femorale dovrebbe rendere termoretraibile mentre la stessa nella vena femorale dovrebbe engorge esso.
   11. Posizionare la base della camera di ingegneria dei tessuti sotto il ciclo arterovenosa con quest'ultimo riposo nella sua posizione naturale senza torsioni o piegature.
   12. Fissare la base della camera al legamento inguinale e sottostante fascia muscolare con 6/0 punti di sutura in nylon.
   13. Mettere il coperchio sopra ilbase in modo che i vasi femorali entrano nella camera attraverso una tacca (finestra nel lato della camera). Quando si chiude il coperchio, assicurarsi che cattura i rami epigastrico, tra la base e il coperchio della camera, che agiscono come pastoie di tenere l'anello artero-venosa in posizione.
   14. Chiudere la ferita con funzionamento continuo 4/0 sutura di seta più due o tre ulteriori semplici punti interrotti.
   15. Lasciare che l'animale per recuperare da anestesia su un blocco di riscaldamento.
   16. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Allo stesso modo, non restituiscono un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. 24 ore più tardi, somministrare un'altra dose singola di Carprofen (5 mg / kg, per via sottocutanea) come analgesico.
   17. Trattare la ferita con attualità pomata antibiotica per 5 giorni. Se la ferita è aperta, anestetizzare l'animale come al punto 1.1.2 tramite 1.1.5 e chiudere la ferita come in 1.3.14. Monitorare la salute di animali al giorno. Eutanasia l'animale con una dose letale di iniezione lethabarb intraperitoneale (163 mg / kg a 0,25 ml per 23 ago G) se l'animale mostra più di segni moderati di inacitivity, scarso appetito, perdita di peso e perdita di colore.

2. flusso continuo Pedicle Camera (due camere per animale)

1. Preparazione del Animal per la chirurgia
   1. Ripetere i passaggi 1.1.1 tramite 1.1.4. Due camere possono essere impiantati in entrambe le regioni all'inguine di un singolo topo.
2. Isolamento di vasi femorali e inserimento di sezione
   1. Ripetere i passaggi 1.2.1 tramite 1.2.8.
   2. Con entrambi arteria e vena completamente liberata tessuti circostanti e loro rami ligato, portare la camera nel campo operatorio.
   3. Mettere ciascuno dei vasi femorali intatte sulla corrispondente feritoia della base della camera assicurandosi che non vi siano torsioni o curvature.
   4. Chiudere la camera da attaching il coperchio alla base. Chiudere la ferita utilizzando funzionamento continuo 4/0 sutura seta più di due o tre ulteriori semplici punti interrotti e permettere all'animale di recuperare come precedentemente descritto.

3. Raccolta delle Camere e la lavorazione dei tessuti

1. Una volta punti di tempo dell'esperimento (4-6 settimane post-impianto) vengono raggiunti, anestetizzare l'animale come al punto 1.1.2 e 1.1.3 ripetere i passaggi attraverso 1.1.5.
2. Aprire la ferita con una lama # 15 e tagliare i tessuti con le forbici finché la camera è completamente esposto.
3. Esporre i vasi femorali prossimale al costrutto e di prova per la pervietà vascolare: occlude delicatamente il vaso con due microforceps, poi il latte il sangue in una direzione distale e, infine, rilasciare il forcipe prossimali. Se la nave si riempie di sangue nuovo, ciò conferma la pervietà. Legare i vasi femorali prossimalmente nel caso del ciclo artero ed entrambi prossimale e distale nel caso di the flow-through configurazione e rimuovere le camere con il tessuto contenente in blocco.
4. Alla fine dell'esperimento, eutanasia l'animale con una dose letale di iniezione lethobarb intraperitoneale (163 mg / kg in 0,25 ml per 23 ago G).
5. Fissare tessuti in paraformaldeide 4% a temperatura ambiente per 24 ore. Tessuti dividere in più sezioni trasversali (1-2 mm di spessore) e incorporare in cera di paraffina o composto ottimale temperatura di taglio per le sezioni di paraffina (5 micron) o sezioni congelate (10 micron), rispettivamente. ^{3,4,8,17,22, 24}
6. Eseguire routine di colorazione istologica come ematossilina ed eosina esaminare la morfologia generale dei tessuti. Eseguire la colorazione immunoistochimica con anticorpi specifici per identificare il tipo cellulare di interesse, ^{3,4,8,17,22,24,29} per T immunostaining esempio, la troponina cardiaca per cardiomiociti.

Risultati

La creazione microchirurgico di camere ingegneria tissutale è stata eseguita come descritto nel protocollo di cui sopra. I tessuti generati all'interno delle camere possono essere esaminate istologicamente come descritto nel passaggio protocollo 3. Vari tipi di tessuto sono stati progettati con successo utilizzando la camera vascolarizzata in vivo (Figura 2). Questi includono tessuto cardiaco con cardiomiociti neonatali di ratto (Figura 2A),

Discussione

Ingegneria della microcircolazione è attualmente in fase di studio essenzialmente attraverso due approcci. La prima comporta lo sviluppo di una rete vascolare altamente interconnessa all'interno del costrutto in vitro in modo che quando impiantato, capillari dal letto vascolare ospitante collegano con quelli del trapiantato costruire attraverso un processo chiamato inosculation, garantendo così la consegna di nutrienti non solo la periferia ma anche al nucleo. ^21,32,33 Questo è chiamato pre-va...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 15 Blade Scalpel	Braun	BB515
1 Toothed Adson Forceps	Braun	BD527R
1 Needle Holder	Braun	BM201R
1 Bipolar Coagulator	Braun	US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5	S & T	00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11	S & T	00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11	S & T	00090
2 Single Clamps B-3	S & T	00400
2 10/0 nylon suture	S & T	03199
1 6/0 nylon suture	Braun	G2095469
2 4/0 Silk Sutures	Braun	C0760145
Xilocaine 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparin Sodium	Dealmed	272301	5000 UI / ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber	custom made
1 flow-through chamber	custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/mL
Troponin T antibody	Abcam	Ab8295	4 μg/mL
Human-specific Ku80 antibody	Abcam	Ab80592	0.06 μg/mL
Desmin antibody	Dako	M0760	2.55 μg/mL
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells